本发明提供了化合物,该化合物是制霉菌素衍生物,其具有在C28和C29之间存在的另外的双键并且其相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰。
1.化合物或其药学可接受的盐,该化合物是制霉菌素衍生物,其具有在C28和C29之间存在的另外的双键并且其相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰,条件是该化合物不是化合物(II)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="640"/>或不是化合物七烯枝菌素(如下所示)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="559"/>或不是化合物制假丝菌素(如下所示)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="596"/>
2.权利要求1的化合物,其在C5位处经过修饰。
3.前述权利要求中任一项的化合物,其在C16处经过修饰。
4.前述权利要求中任一项的化合物,其在C9处经过修饰。
5.前述权利要求中任一项的化合物,其在C10处经过修饰。
6.前述权利要求中任一项的化合物,其在海藻糖胺的氨基处经过修饰。
7.前述权利要求中任一项的化合物,其相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、Cxa011、C16或海藻糖胺的氨基的至少两处经过修饰。
8.式I′的化合物ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="695"/>优选式(I)的化合物,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="585"/>其中,R¹和R²各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基;R¹′和R²′各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基;R³和R⁴各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基;R³′和R⁴′各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基;R⁵和R⁶各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基;R⁷代表氢原子,COOH,烷基,烷氧基,羧酸酯基或酰胺基;R⁸和R⁹各自独立地代表氢原子,烷基氨基,糖基或酰基,或其药学可接受的盐,条件是所述化合物不是化合物(II)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="610"/>或不是化合物七烯枝菌素(如下所示)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="558"/>或不是化合物制假丝菌素(如下所示)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="605"/>
9.权利要求8的化合物,其中R¹代表氢原子、羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6)且R²是氢原子或者其中R¹和R²一起形成羰基。
10.权利要求7-9中任一项的化合物,其中R³代表氢原子、羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6)且R⁴是氢原子或者其中R³和R⁴一起形成羰基。
11.权利要求7-10中任一项的化合物,其中R⁵代表氢原子、羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6)且R⁶是氢原子。
12.权利要求7-11中任一项的化合物,其中R⁷是COOH,烷基,羧酸酯基或酰胺基。
13.权利要求7-12中任一项的化合物,其中R⁸代表氢原子、烷基氨基、糖基或酰基且R⁹与R⁸相同或者是氢原子,例如R⁹是氢原子。
14.权利要求7-13中任一项的化合物,其中R⁷是烷基(例如,甲基)或是酰胺基,例如,式III的酰胺,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="202"/>其中R¹⁰和R¹¹各自独立地代表氢原子或C_1-10支链或非支链的C_1-10烷基,所述烷基任选地被羟基、酰氧基或氨基取代并任选地被氧原子或氮原子间断,或者R¹⁰和R¹¹一起形成C_1-8环状烷基,其任选地被羟基、酰氧基或氨基取代并任选地被氧原子或氮原子间断。
15.权利要求14的化合物,其中R⁷是甲基、CONH(CH₂)_nN(CH₃)₂或CONH(CH₂)_nOH,其中n是2或3。
16.权利要求7-15中任一项的化合物,其中R⁸是其中x是2-6的式-(CH₂)_xNH₂或-(CH₂)_xN(C_1-6烷基)₂的烷基氨基或是选自葡萄糖、半乳糖、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃半乳糖、吡喃果糖和吡喃塔格糖的单糖或是选自乳糖、蜜二糖、蔗糖、麦芽糖和纤维二糖的寡糖。
17.权利要求8-16的化合物,其中R¹和R²一起形成羰基,R³、R⁴和R⁶是氢原子且R⁵是羟基。
18.权利要求8-17的化合物,其中R⁷是C_1-6烷基(例如,甲基)且R⁸和R⁹中至少一个(例如,R⁸和R⁹二者都)是氢原子。
19.权利要求8-18的化合物,其中R⁷是酰胺基,优选上面定义的式III的酰胺基,且R⁸和R⁹中至少一个(例如,R⁸和R⁹二者都)是氢原子。
20.权利要求8-19的化合物,其中R⁸是糖基或烷基氨基且R⁹是氢原子。
21.权利要求8-20的化合物,其包含以下的骨架:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="482"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="521"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="588"/>化合物1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="636"/>其中在16位的COOH还可是对R⁷定义的酰胺基或羧酸酯基。
22.权利要求8的化合物,其选自图1中所示的化合物。
23.权利要求8的化合物,其选自:化合物1、2、9、11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、28、29、41、48和51。
24.权利要求8的化合物,其选自:化合物1、2、9、11、12、13、14、21和22。
25.前述权利要求中任一项的化合物,其为谷氨酸盐的形式。
26.制备前述权利要求中任一项的化合物的方法,该方法包括:(i)修饰编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇以产生在C28和C29之间具有双键的制霉菌素衍生物;和(ii)另外修饰所述基因簇以产生在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过修饰的制霉菌素衍生物,或者(iii)通过化学反应在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处修饰所得到的衍生物。
27.包含权利要求1-24中任一项的化合物和载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
28.权利要求27的组合物,其是药物。
29.权利要求1-25中任一项的化合物,其用于治疗。
30.权利要求1-25中任一项的化合物在制备用于治疗真菌感染的组合物中的应用。
31.在动物中治疗真菌感染的方法,包括对所述动物施用权利要求1-25中任一项的化合物。
32.权利要求1-25中任一项的化合物作为消毒剂或防腐剂的应用。本发明涉及新型制霉菌素衍生物及其制备方法。本发明特别地涉及该新型制霉菌素衍生物在医学中的应用,特别是作为抗真菌剂的应用。制霉菌素是由革兰氏阳性细菌诺尔斯氏链霉菌(Streptomycesnoursei)的某些菌株产生的天然存在的抗真菌物质的复合物。制霉菌素的主要成分是制霉菌素A₁,其是具有如下所示结构的多烯大环内酯:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="573"/>制霉菌素是存在于许多供治疗皮肤和粘膜的念珠菌病使用的专利性制剂(例如Infestat,Nyspes,Nystamont,Nystan,Mycostatin和Nilstat)中的活性剂。其通常经过口服或局部给药,尽管其从胃肠道的吸收或穿过皮肤和膜的吸收差。这是因为当经过非肠道给药时其具有毒性。制霉菌素属于多烯大环内酯抗生素家族。该家族的其它成员包括匹马霉素,龟裂霉素,克念菌素,生金菌素,来伏林和两性霉素。两性霉素是最常用的抗真菌剂,因为它一般被认为是最有效的。其具有广谱的抗真菌活性,但是,像制霉菌素那样,两性霉素具有的主要缺点,毒性,限制了其可使用的给药途径和剂量。因此对大环内酯聚酮类抗生素进行的研究工作集中在两性霉素上,并且特别是鉴定具有更低毒性的新型两性霉素类似物。一般采用两种不同的手段。在第一种手段中,研究人员已经使用化学修饰来试图降低两性霉素的毒性和/或改善其抗真菌活性。然而,因为两性霉素的总合成在经济上不可行,起始材料通常是得自结节链霉菌(Streptomycesxa0nodosus)培养物的两性霉素B。结果是,化学修饰已集中于对两性霉素B环上存在的官能团进行衍生化。更近些年来,研究人员已经采取以两性霉素的生物合成途径为目标的不同的手段,该生物合成途径由不同酶的装配线组成。两性霉素的碳链通过模块(1型)聚酮合酶从乙酸和丙酸单元进行组装,并且所得到的大环内酯随后通过其它的引起氧化、糖基化和羟基化作用的酶进行修饰。编码参予该生物合成的酶的基因已被鉴定,因此研究人员已能通过例如缺失、添加或修饰基因并从而缺失、添加或修饰参予该合成的酶而向天然生物合成途径中引入变化。净结果是经过修饰的两性霉素分子。许多经修饰的两性霉素分子因而被制备和试验,特别是经化学修饰的衍生物。然而,尽管存在这些努力,但是很少鉴定出有前途的药物候选物,具有适当的药理学性质的平衡,即高的抗真菌活性、低毒性和水溶性。因此仍然存在对治疗感染性疾病、特别是发病率升高的急性全身真菌感染的新型抗生素的需求。这一要求随着对现有抗真菌剂的耐药性的发展而变得愈加急迫。与两性霉素相比,很少进行修饰制霉菌素的研究,大概是因为制霉菌素比两性霉素具有的活性低,并仍旧受到相同的毒性和水不溶性缺点的困扰。结果是,制霉菌素不被认为是用于这一工作的有吸引力的起始分子。在新近的研究中(Organicxa0Letters,2006,8(9),1807-1809),通过海藻糖胺的氨基的还原性烷基化制备了两个制霉菌素衍生物。得到的衍生物被发现比制霉菌素具有更高的抗真菌活性,但是比以同样的方法制备的两性霉素B衍生物的活性低。两性霉素B的修饰因此被认为更有前途并且这些衍生物的毒性经过试验显示比母体分子有显著降低。在WO01/59126中,描述了编码聚酮合酶和其它负责制霉菌素合成的酶的基因簇的克隆和测序。WO01/59126还接着提出了在理论上可以对基因簇进行很多的可能的操纵以获得经过修饰的制霉菌素结构。这些包括从制霉菌素的多烯片段缺失或添加双键的修饰,缺失或换位C16羧基的修饰,添加另外的羟基的修饰和截短大环内酯环的修饰。从前面所述马上可以清楚,通过进行WO01/59126中所建议的一种或多种修饰,可以制备巨大数目(约10¹⁷个)的不同的经过修饰的制霉菌素结构。然后使用另外的化学修饰对通过基因操作得到的任一化合物进行进一步修饰的可能性意味着在理论上可能获得10³⁰个化合物。然而,因为对制霉菌素进行的研究如此少,因此没有可用的数据来建议这些巨大数目的化合物中的哪些可能比制霉菌素和/或两性霉素(即目前使用的那些活性剂)表现出更低的毒性。然而,目前出人意料地发现某些制霉菌素衍生物比两性霉素具有显著更低的毒性,并且有利地是,同样的衍生物还被发现表现出有效的抗真菌活性。与大多数已制备的经过修饰的两性霉素化合物不同,制霉菌素衍生物目前已被定为是“第二代”衍生物。换句话说,这些化合物是制霉菌素的衍生物的衍生物并因此包括相对于制霉菌素A₁的结构进行的两种或更多种修饰。因此,从本发明的第一方面看,提供了化合物或其药学可接受的盐,该化合物是制霉菌素衍生物,其在C28和C29之间具有另外的双键并且相对于制霉菌素在C5、C9、C10、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰。从本发明的另一方面看,提供了化合物或其药学可接受的盐,该化合物是制霉菌素衍生物,其在C28和C29之间具有另外的双键并且相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰。本发明的优选化合物是下式I的化合物或其药学可接受的盐,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="609"/>其中R¹和R²各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基(例如,R¹和R²各自独立地代表氢原子或羟基或者一起形成羰基;R³和R⁴各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基或者一起形成羰基(例如,R³和R⁴各自独立地代表氢原子或羟基或者一起形成羰基;R⁵和R⁶各自独立地代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基(例如,氢原子或羟基);R⁷代表氢原子,COOH,烷基,烷氧基,羧酸酯基或酰胺基(例如,COOH,烷基,羧酸酯基或酰胺基);R⁸和R⁹各自独立地代表氢原子,烷基氨基,糖基或酰基;条件是该化合物不是化合物(II)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="610"/>或不是化合物七烯枝菌素(如下所示)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="570"/>本发明的另外优选化合物,也服从于上述条件,是式(I)的化合物,但是其中7位碳和/或11位碳处的-OH基被转化为例如氧代基团。这就是(I′),即ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="543"/>其中所有的取代基与对式(I)定义的相同并且R¹′、R²′、R³′和R⁴′各自独立地与对R¹-R⁴各自的定义相同,并且附加条件是式(I′)的化合物不是制假丝菌素(如下所示),ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="616"/>从另一方面看,本发明提供了制备上述化合物的方法,该方法包括:(i)修饰编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇以产生在C28和C29之间具有双键的制霉菌素衍生物;和(ii)另外修饰所述基因簇以产生在C5、C9、C10、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰的制霉菌素衍生物,或者(iii)通过化学反应在C5、C9、C10、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处修饰得到的衍生物。从另一方面看,本发明提供了制备上述化合物的方法,该方法包括:(i)修饰编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇以产生在C28和C29之间具有双键的制霉菌素衍生物;和(ii)另外修饰所述基因簇以产生在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰的制霉菌素衍生物,或者(iii)通过化学反应在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处修饰得到的衍生物。从又一个方面看,本发明提供了包含上述的化合物和载体、稀释剂或赋形剂的组合物。优选的组合物是药物组合物。从另一个方面看,本发明提供了用于治疗应用的本文上述的化合物。上述的化合物在制备用于治疗真菌感染的组合物中的应用构成了本发明的另一方面。在动物(例如,人)中治疗真菌感染的方法,包括对所述动物施用前面定义的化合物,构成了本发明的又一方面。本文使用的术语“制霉菌素衍生物”意在涵盖了除了明确说明的具体修饰之外,与制霉菌素A₁具有相同的结构的化合物。因此,优选的衍生物除了在C28-C29处的另外的双键之外,与制霉菌素具有相同的大环内酯环,并且除了在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处的修饰之外,与制霉菌素具有相同的官能团。因此,优选的衍生物包括如下所示的糖基化的大环内酯环骨架:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="593"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="617"/>可理解,在这些式中,可在C5、C9、C10、C16处和在海藻糖胺的N上存在修饰。因此,所显示的只是必须存在的原子。这些图式显示了可以存在的化学骨架。本文使用的术语“聚酮合酶系统”是指负责聚酮合成和修饰的酶的集合。其包括聚酮合酶,单加氧酶,糖基转移酶和转氨酶。本文使用的术语“烷基”代表环状或非环状的、直链或支链的、饱和烃基。这些烷基可含最多20个碳原子,但是优选含1-12个碳原子的烷基,更优选含1-6个碳原子的烷基。烷基可未被取代或被取代。可存在于被取代的烷基中的取代基包括羟基、烷氧基、酰氧基和氨基。烷基还可被一个或多个基团间断,例如,-芳基-(诸如Ph)、-O-、-NR¹²-或-S-,其中R¹²代表氢原子或C_1-6烷基。本文使用的术语“烷氧基”代表基团-OR¹³,其中R¹³是如前定义的烷基。在优选的烷氧基中,R¹³含1-6个碳原子,更优选含1-4个碳原子。优选的烷氧基是-OC_1-6,例如-OCH₃。本文使用的术语“酰氧基”代表基团-OCOR¹⁴,其中R¹⁴是如前定义的烷基。在优选的酰氧基中,R¹⁴含1-6个碳原子,更优选含1-4个碳原子。优选的酰氧基是-OCOC_1-6,例如-OCOCH₃。本文使用的术语“羧酸酯基”代表基团-COOR¹⁵,其中R¹⁵是如前定义的烷基。在优选的羧酸酯基中,R¹⁵含1-6个碳原子,更优选含1-4个碳原子。优选的羧酸酯基是-COOC_1-6,例如-COOCH₃。本文使用的术语“酰胺基”代表下式III的基团:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="133"/>其中R¹⁰和R¹¹各自独立地代表氢原子或任选被取代的如前定义的烷基或者一起形成如前定义的烷基环。本文使用的术语“烷基氨基”代表基团-(CH₂)_xNR¹⁶R¹⁷,其中x是1-10,优选2-6(例如,3)并且R¹⁶和R¹⁷各自独立地代表氢原子或C_1-6烷基。本文使用的术语“糖”代表糖类(saccharides),特别是寡糖和单糖。存在于本发明的化合物的化合物中的糖可包括许多个糖单元,但是优选的化合物包括1-10个糖单元,例如1或2个糖单元。本文使用的术语“酰基”代表基团-COR¹⁸,其中R¹⁸是如前定义的烷基。在优选的酰基中,R¹⁸是被取代的烷基,例如被氨基取代的烷基。特别优选的酰基是氨基酰基。如上文所述,本发明的化合物是制霉菌素衍生物,其在C28和C29之间具有另外的双键并且其相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰。本发明的优选化合物相对于制霉菌素在C5处经过修饰。在制霉菌素中,C5被羟基和氢原子取代并且是R立构中心。因此,在本发明的优选的化合物中,C5被不同于羟基和氢原子的基团取代和/或C5是S立构中心。在优选的化合物中,不同的基团存在于C5处,例如,C5可被两个羟基或被两个氢原子取代。在特别优选的化合物中,C5被羰基取代。本发明的其它优选的化合物相对于制霉菌素在C16处经过修饰。在制霉菌素中,C16被羧酸和氢原子取代并且是R立构中心。因此,在本发明的优选的化合物中,C16被不同于羧酸基团和氢原子的基团取代和/或C16是S立构中心。在优选的化合物中,不同的基团存在于C16处,例如烷基(例如,甲基)和氢原子,或酰胺基和氢原子。在特别优选的化合物中,C16被甲基和氢原子取代。在优选的化合物中,C16是R立构中心。本发明的另外的优选化合物相对于制霉菌素在C9处经过修饰。在制霉菌素中,C9被两个氢原子取代。因此,在本发明的优选化合物中,C9被不同于两个氢原子的基团取代。在优选的化合物中,不同的基团存在于C9处,例如羟基和氢原子,或羰基。本发明的另外的优选化合物可以相对于制霉菌素在C7处经过修饰。在制霉菌素中,C7被羟基取代。因此,在本发明的一些化合物中,C7被不同于羟基的基团取代。在优选的化合物中,羰基存在于C7处。当存在羰基时,还有必要相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或海藻糖胺的N处进一步修饰化合物,以排除如上所示的化合物制假丝菌素。本发明的另外的优选化合物可以相对于制霉菌素在C11处经过修饰。在制霉菌素中,C11被羟基取代。因此,在本发明的一些化合物中,C11被不同于羟基的基团取代。在优选的化合物中,羰基存在于C11处。本发明的更进一步优选的化合物相对于制霉菌素在C10处经过修饰。在制霉菌素中,C10被羟基和氢原子取代并且是R立构中心。因此,在本发明的优选的化合物中,C10被不同于羟基和氢原子的基团取代和/或C10是S立构中心。在优选的化合物中,不同的基团存在于C10处,例如两个氢原子,或羰基。在特别优选的化合物中,C10被两个氢原子取代。本发明的仍然进一步优选的化合物相对于制霉菌素在海藻糖胺的氨基处经过修饰。在制霉菌素中,海藻糖胺的氨基未被取代,即,其是-NH₂。因此,在本发明的优选的化合物中,海藻糖胺的氨基被取代,例如被一个或多个烷基氨基或糖基取代。当本发明的化合物在C5或C7处具有羰基时,如果还提供了相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处对所述化合物经过进一步修饰,是特别优选的。例如,海藻糖胺的胺可经过官能化以携带至少一个不同于氢的取代基R⁸/R⁹。虽然本发明的化合物可以相对于已知物质诸如S44HP只含有一个改变,但在本发明的任何化合物中,理想地是,其将相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括两个改变。优选的化合物可以相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括三个改变。另外优选的化合物将相对于S44HP在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括至少两个改变。其它优选的化合物将相对于七烯枝菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括至少两个改变。另外优选的化合物将相对于制假丝菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括至少两个改变。特别优选的化合物将相对于所有的制霉菌素、S44HP、七烯枝菌素和制假丝菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16或在海藻糖胺的N处包括至少两个改变。本发明的特别优选的化合物是上文说明的式(I)或(I′)的那些。在优选的式(I)的化合物中,R¹代表氢原子,羟基,烷氧基,酰氧基或烷基。仍更优选地,R¹代表氢原子,羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6),特别是氢原子或羟基(例如,羟基)。在优选的化合物中,R²是氢原子。在可供选择的优选化合物中,R¹和R²一起形成羰基。当C5是立构中心时,其优选是R立构中心。优选的式(I)的化合物还有其中R³代表氢原子、羟基、烷氧基、酰氧基或烷基的那些。仍更优选地,R³代表氢原子,羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6),特别是氢原子或羟基(例如,氢原子)。在优选的化合物中,R⁴是氢原子。在可供选择的优选的化合物中,R³和R⁴一起形成羰基。当C9是立构中心时,其优选是R立构中心。另外优选的式(I)的化合物还有其中R⁵代表氢原子、羟基、烷氧基、酰氧基或烷基的那些。仍更优选地,R⁵代表氢原子、羟基或烷氧基(例如,基团-OC_1-6),特别是氢原子或羟基(例如,羟基)。在优选的化合物中,R⁶是氢原子。当C10是立构中心时,其优选是R立构中心。再另外优选的式(I)的化合物是其中R⁷代表COOH、烷基、羧酸酯基或酰胺基的那些。优选的羧酸酯基是-COOC_1-6,更优选是-COOC_1-4,例如-COOCH₃。特别优选的式(I)的化合物是其中R⁷是烷基或酰胺基的那些。优选的烷基是C_1-6烷基,例如甲基,乙基,丙基或丁基,特别是甲基。优选的酰胺是如前定义的式III的那些。特别优选的酰胺是其中R¹⁰和R¹¹各自独立地代表氢原子或C_1-10支链或非支链的C_1-10烷基,所述烷基任选地被羟基、羧酸酯基或氨基取代并任选地被氧原子或氮原子间断,或者R¹⁰和R¹¹一起形成C_1-8环状烷基,其任选地被羟基、酰氧基或氨基取代并任选地被氧原子或氮原子间断。在一些优选的酰胺中,R¹⁰是氢。在其它优选的酰胺中,R¹¹是式IV的基团:-(CHR¹⁸)_yZxa0xa0(IV)其中R¹⁸是氢或含最多6个碳原子的烷基(例如,甲基或CH(CH₃)₂);y是1-6,优选2-4,例如是3;和Z是OH、NR¹⁹R²⁰或COOR²¹,其中R¹⁸、R¹⁹和R²¹各自独立地是氢或C_1-6烷基(例如,甲基)。在特别优选的酰胺中,R¹⁸是氢。在其它优选的酰胺中,R¹⁰和R¹¹一起形成环状烷基,优选式V的环状烷基,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="267"/>其中a、b和c各自独立地代表1-6,优选2-4,例如2;和Z如上文关于式IV的定义。特别优选的式III的酰胺基的代表性实例是以下所示的那些:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="658"/>特别优选酰胺基4、6、7、8和10,尤其是酰胺基7和10。此外优选的式(I)的化合物是其中R⁸代表氢原子、烷基氨基、糖基或酰基的那些。在优选的化合物中,R⁹与R⁸相同或是氢原子,例如,R⁹是氢原子。优选的烷基氨基是其中x是2-6(例如3)的式-(CH₂)_xNH₂的那些或其烷基化类似物-(CH₂)_xNC_1-6烷基₂,例如-(CH₂)_xNMe₂。另一个优选的基团是赖氨酸残基COCH[(CH₂)₄NH₂]NH₂。优选的糖基包括1-5个糖单元,更优选包括2或3个糖单元。当糖基是单糖时,其可作为直链构象异构体、环状构象异构体或直链和环状构象异构体的混合物存在。当糖基包括超过一个的糖单元时,每个单糖可为环状构象异构体、直链构象异构体或直链和环状构象异构体的混合物。另外,存在的糖单元可相同或不同。在式(I)的化合物中,优选的单糖是戊糖和己糖,例如葡萄糖,半乳糖,吡喃葡萄糖,吡喃甘露糖,吡喃半乳糖,吡喃果糖和吡喃塔格糖。优选的二糖和寡糖包含乳糖,蜜二糖,蔗糖,麦芽糖和纤维二糖。D-葡萄糖、D-半乳糖和乳糖是特别优选的。其它优选的酰基(对于R⁸而言)包括-(CH₂)Ph(CH₂)_xNH₂或-(CH₂)Ph(CH₂)_xNMe₂,其中x是0/1。本发明特别优选的化合物是其中R¹和R²一起形成羰基的式I的那些。更优选地,当R¹和R²形成羰基时,R³、R⁴和R⁶是氢原子且R⁵是羟基。在这样的化合物中,优选R⁸和R⁹中至少一个(例如R⁸和R⁹二者都)是氢原子。特别优选地,C10是R立构中心。本发明的其它特别优选的化合物是其中R⁷是C_1-6烷基(例如,甲基)的式I的那些。更优选地,当R⁷是C_1-6烷基(例如,甲基)时,R⁸和R⁹中至少一个(例如R⁸和R⁹二者都)是氢原子。在这样的化合物中,R⁵优选是羟基和R⁶优选是氢原子。仍更优选地,R³和R⁴是氢原子。特别优选地,C10是R立构中心。本发明的仍进一步优选的化合物是其中R⁷是酰胺基、优选如前定义的式III的酰胺基的式I的那些。更优选地,当R⁷是酰胺基时,R⁸和R⁹中至少一个(例如R⁸和R⁹二者都)是氢原子。在这样的化合物中,R⁵优选是羟基和R⁶优选是氢原子。仍更优选地,R³和R⁴是氢原子。特别优选地,C10是R立构中心。本发明的更进一步优选的化合物是其中R⁸是如前定义的糖基或烷基氨基的式I的那些。更优选地,当R⁸是糖基或烷基氨基时,R⁹是氢原子。在这样的化合物中,R⁷优选是COOH。仍更优选地,R⁵是羟基且R⁶是氢原子和/或R³和R⁴是氢原子。特别优选地,C10是R立构中心。对于式(I′)的化合物,优选的选择是如上文就式(I)所述的那些。另外,在优选的式(I′)的化合物中,R¹′代表羟基和R²′是氢原子或者R¹′和R²′一起形成羰基。当C7是立构中心时,其优选是R中心。优选的式(I′)的化合物还有其中R³′代表羟基和R⁴′是氢原子或者R³′和R⁴′代表羰基的那些。当C11是立构中心时,其优选是R中心。优选R¹′/R²′一起或者R³′/R⁴′一起,只有一对代表羰基。本发明的优选化合物的代表性实例如图1所示。特别优选的化合物是编号为1、2、9、11、12、13、14、15、16、17、18、21和22的化合物,特别是编号为1、2、9、11、12、13、14、21和22的化合物,例如化合物1和11。另外优选的化合物是其中C16羧基被转化为二甲基乙基酰胺的那些。还优选其中相同的羧基被转化为甲基的化合物。特别优选的化合物包含具有上述的C16变化之一以及在多元醇区域(C5-C11)中的改变的那些。如上所述,本发明的化合物可采取药学可接受的盐的形式。这样的盐包括与生理学可接受的有机酸或无机酸的酸加成盐。适合用于形成这样的盐的酸的实例包括:乙酸,天冬氨酸,苯磺酸,苯甲酸,二碳酸,焦硫酸,二酒石酸,丁酸,依地酸钙,右旋樟腦磺酸(camsylic),碳酸,氯苯甲酸,柠檬酸,依地酸,edisylicxa0acid,estolicxa0acid,esylxa0acid,esylicxa0acid,甲酸,富马酸,葡庚酸,葡糖酸,谷氨酸,乙醇酰基氨苯胂酸,环己磺酸,hexylresorcinoic,hydrabamicxa0acid,氢溴酸,盐酸,氢碘酸,羟萘甲酸,羟乙磺酸,乳酸,乳糖酸,马来酸,苹果酸,丙二酸,扁桃酸,甲磺酸,甲基硝酸,甲基硫酸,粘酸,粘康酸,napsylicacid,硝酸,草酸,对硝基甲磺酸,扑酸,泛酸,磷酸,一氢磷酸,二氢磷酸,邻苯二甲酸,多聚半乳糖醛酸,丙酸,水杨酸,硬脂酸,琥珀酸,氨基磺酸,对氨基苯磺酸,磺酸,硫酸,鞣酸,酒石酸,teoclicacid(叶酸)和甲苯磺酸。特别优选谷氨酸盐。或者,可与碱形成盐。合适的用于形成这些盐的碱的实例包括:伯、仲和叔胺,被取代的胺,包括天然存在的被取代的胺、环胺、精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N-二苄基乙二胺,二乙胺,2-二乙基氨基乙醇,2-二甲基氨基乙醇,乙醇胺,乙二胺,N-乙基吗啉,N-乙基哌啶,葡糖胺,氨基葡糖胺,组氨酸,哈胺,异丙胺,赖氨酸,甲基葡糖胺,吗啉,哌嗪,哌啶,聚胺树脂,普鲁卡因,嘌呤,可可碱,三乙胺,三甲胺和三丙胺。药学可接受的盐可为水合形式。将式I的化合物转化为这些盐的过程是本领域的常规过程。本发明的高度优选的化合物可源自以下骨架(其中在16位上的COOH基团或氨基根据需要进行官能化,例如,其中COOH被R7替换)。注意,这些骨架上的氢原子一般未被画出。可理解,这些氢原子仍旧存在(即,在原子-O上形成羟基):B1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="483"/>B2(其中16位上的COOH基团或N基被官能化)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="437"/>B3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="482"/>B4ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="519"/>B5ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="586"/>B6ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="546"/>B7ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="535"/>化合物1(实施例的)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="622"/>S44HP(其中16位上的COOH基团或N基被官能化)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="601"/>可理解,在本发明的化合物中存在许多变量。为了避免疑惑,强调指出每个变量定义的公开被认为与本申请中所有其它变量的定义相关联进行公开。因此,特别是,对于每个变量的优选选择可与用于任何其它变量的较不优选的选择和优选的选择组合。本发明的化合物可使用本领域的已知过程,包括常规的合成化学、基因操作或其组合来制备。如上所述,本发明的一方面提供了制备上述化合物的方法,该方法包括:(i)修饰编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇以产生在C28和C29之间具有双键的制霉菌素衍生物;和(ii)另外修饰所述基因簇以产生在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处经过进一步修饰的制霉菌素衍生物,或者(iii)通过化学反应在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处修饰得到的衍生物。本发明的优选方法包括步骤(i)和(ii),即,修饰编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇以产生在C28和C29之间具有双键的制霉菌素衍生物和相对于制霉菌素在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或海藻糖胺的氨基处(例如,在C5、C9、C10或C16的一个或多个位置处)的进一步修饰。本发明的第二优选的方法包括步骤(i)和(iii)。编码负责制霉菌素合成的聚酮合酶系统的基因簇的修饰可根据常规过程诸如WO01/59126中所述进行。制霉菌素聚酮合酶基因簇编码许多重复单元(模块),其每个负责聚酮链合成中的一个缩合环。有负载模块(nysA),其决定了用于引发聚酮链合成的“起动物”单元(羧酸)的性质,和18个“延伸”模块,其用于并入(缩合到所述链上)另外的“延伸物”单元(被添加到所述链上的下一个羧酸)。每个这样的模块从而编码许多的导致分子合成的酶活性(例如,酶);所述模块含有单独编码这些活性的结构域。因此,模块典型地包括用于合成和延伸的酰基转移酶(AT)结构域,酰基载体蛋白(ACP)结构域和β-酮酰基合酶(KS)结构域,(决定被并入的起动物/延伸物单元的还原状态的酮还原酶(KR)、脱水酶(DH)和烯酰还原酶(ER)结构域。基因簇另外包含编码参予制霉菌素生物合成的其它酶(或酶活性)的基因(或开放阅读框,ORF)。因此,硫酯酶(TE)可允许从PKS释放聚酮。另外,在基因簇中的基因或基因序列可编码酶或酶活性,这些酶或酶活性可另外通过例如羟基化作用如单加氧酶(例如,nysN或nysL)或通过糖基化作用(例如,葡糖醛酸基转移酶活性例如nysxa0DI),修饰所合成的分子(聚酮链)。因此,PKS基因簇的模块和/或结构域可通过例如插入、缺失或失活或通过结构域或模块的取代或通过结构域或模块的突变而进行修饰,以改变其活性。因此,模块和/或结构域的数目可经过修饰,或者它们可经过改变,从而改变它们的活性。其它的编码其它酶活性例如单加氧酶或糖基转移酶的基因或基因序列也可经过修饰。典型地,在一个或多个模块中的“还原”结构域(例如,ER、DH和/或KR)可经过修饰(例如,失活),或者编码单氧合酶活性(例如,NysL、NysN)的基因序列可经过修饰(例如,失活)。在C28和C29之间的双键可根据例如WO01/59126的实施例2中所述通过使聚酮合酶的模块5内的ER结构域失活而被引入。相对于制霉菌素在例如C5、C9、C10或C16的一个或多个位置处的进一步修饰可通过对编码聚酮合酶系统的基因簇进行的其它修饰而被引入。当对基因簇进行进一步修饰时,它们优选产生相对于制霉菌素在C5、C9、C10或C16的一个或多个位置处的修饰。制霉菌素结构在C5处的修饰可通过,例如实施例中所述的方法,使制霉菌素聚酮合酶的模块17内的酮还原酶结构域失活而发生。制霉菌素结构在C9处的修饰可通过,例如实施例中所述的方法,使制霉菌素聚酮合酶的模块15内的酮还原酶结构域失活而发生。制霉菌素结构在C10处的修饰可通过,例如实施例中所述的方法,使负责C10羟基化的NysL单加氧酶的基因失活而发生。制霉菌素结构在C7处的修饰可通过KR16结构域的失活而发生。制霉菌素结构在C11处的修饰可通过KR14结构域的失活而发生。制霉菌素结构在C16处的修饰可通过,例如实施例中所述的方法,P540单加氧酶编码基因nysN的失活而发生。对得自步骤(i)和任选的步骤(ii)的化合物通过化学反应在C5、C7、C9、C10、C11、C16的一个或多个位置处或在海藻糖胺的氨基处做进一步修饰可通过任何已知的过程进行。当必要时还可使用常规的保护基化学。当通过化学反应引入进一步修饰时,它们优选产生相对于制霉菌素在C16位和/或在海藻糖胺的氨基处的修饰。优选的化学反应是在C16处的酰胺形成。制霉菌素COOH基团向酰胺的转化可通过使制霉菌素衍生物与合适的胺反应来进行,任选存在活化剂(例如,PyBOP)。另一个优选的化学反应是在海藻糖胺的氨基处的还原烷基化。还原烷基化可通过使制霉菌素衍生物与合适的醛反应以形成亚胺并通过添加还原剂优选原地还原该亚胺来进行。优选的还原剂是NaBH₃CN。另外优选的化学反应是在海藻糖胺的氨基处的Amadori反应。Amadori反应可通过使制霉菌素衍生物与合适的还原糖反应来进行。本发明的优选方法给出上述的式(I)的化合物。在这些方法中,在C5处的修饰相对于制霉菌素修饰了R¹和/或R²,在C9处的修饰相对于制霉菌素修饰了R³和/或R⁴,在C10处的修饰相对于制霉菌素修饰了R⁵和/或R⁶以及在C16处的修饰相对于制霉菌素修饰了R⁷。在海藻糖胺的氨基处的修饰相对于制霉菌素修饰了R⁸和R⁹。优选的方法是获得对于式I的化合物是优选的、本文所明确说明的R¹-R⁹的那些方法。所述化合物可通过任何常规技术例如结晶、色谱法等纯化。本发明的式I的化合物含有许多手性中心并且就这样以不同的立体异构形式存在。特别优选的化合物如图1所示。本发明的化合物可用在许许多多的应用中,用于抑制真菌生长或杀灭真菌。例如,本发明的化合物可用作消毒剂或防腐剂(例如,用在食品和化妆品中)。本发明的化合物作为消毒剂或防腐剂的应用构成了本发明的另一方面。对于用作消毒剂或防腐剂,本发明的化合物可单独使用或与其它的抗真菌剂和/或抗细菌剂组合使用。所述化合物可自身直接使用,或者更优选以与载体、稀释剂或赋形剂的混合物使用。本发明的化合物特别适于治疗或预防真菌感染。本发明的化合物和药物组合物特别适于治疗或预防体内和体表区域的真菌感染。可别治疗的所述身体区域的实例包括皮肤、口、阴道和胃肠道。化合物和组合物特别适于治疗侵袭性(例如,全身性)真菌感染。本发明的化合物理想地具有广谱活性,但是特别适于治疗由以下菌种引起的真菌感染:假丝酵母(Candida),隐球酵母(Cryptococcus),曲霉(Aspergillus),毛盘孢(Colletotrichum),地霉(Geotrichum),Hormonema,烧瓶状霉(Lecythophora),拟青霉(Paecilomyces),青霉(Penicillium),红酵母(Rhodotorula),镰孢(Fusarium),酵母(Saccharomyces),木霉(Trichoderma),发癣菌(Trichophyton)和Scopularilopsis菌种,特别是假丝酵母和隐球酵母菌种(例如,假丝酵母菌种)。为了用于这些治疗,化合物可以用常规的方式与一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂被配制成药物组合物。特定的药物制剂将取决于所需的给药方式并且可由本领域技术人员容易地确定。合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括水,乙醇,甘油,聚乙二醇,氯化钠,脱氧胆酸钠,糖(例如,葡萄糖、蔗糖或乳糖),淀粉(例如,谷物淀粉或玉米淀粉),微晶纤维素,胶类(例如,黄蓍胶),山梨醇,甘露醇,木糖醇,硬脂酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,脂肪酸(例如,硬脂酸),脂肪,蜡,碳酸钙,氯化钙和柠檬酸。这样的药物组合物可另外包含一种或多种润湿剂、甜味料(例如,糖、阿斯巴甜或糖精)、润滑剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、调味剂(例如,香草醛、薄荷油或水果香料)和/或吸收增强剂。本发明的化合物如果希望的话,可与另外的(例如,一种、两种或三种)药学活性物质共同给药。与使用本发明的化合物与另外的(例如,一种)活性物质的组合有关的优点是其可增加组合物适合作为药物使用的疾病谱。另外或替代,可有利地实现本发明的化合物和/或另外的活性物质的剂量的降低。当所述的另外的活性物质与已知的副作用有关时,这一优点是特别有利的。可在本发明的组合物中使用的另外的活性物质包括其它的抗真菌剂和抗生素。代表性的抗真菌剂是唑类和棘球白素类(echinocandins)。代表性的抗生素包含地美环素,曲安奈德,硫酸新霉素,短杆菌肽,土霉素和红霉素。根据本发明使用的药物组合物可口服给药、直肠给药(例如,使用栓剂)、局部给药或全身给药。所选择的途径将根据例如待治疗的疾病和/或受试者而定,尽管优选口服和全身给药的组合物。特别优选用于全身给药的组合物。组合物可以任何适宜于在所选的给药途径中使用的形式存在。适于口服给药的形式包括,例如,普通片剂或包衣片剂,持续释放片剂,咀嚼片,软胶囊,硬胶囊,悬浮剂和糖浆剂。根据本发明的优选形式是片剂,悬浮剂和糖浆剂,特别是片剂。适于全身给药的形式可为,例如,用于皮内、腹膜内或静脉内注射或输注的制剂。特别优选用于静脉内注射的制剂。适宜于局部给药的形式包括用于给药至皮肤和粘膜的组合物(例如,凝胶剂,霜剂,喷雾剂,洗剂,油膏剂和气雾剂)。化合物还可被配制在直肠或阴道组合物诸如栓剂或保留灌肠剂中。本发明的化合物在任何应用中的用量可由本领域技术人员容易地确定。例如,对于用作消毒剂或防腐剂,需要的化合物的量是抑制目标真菌生长或使目标真菌致死的量。对于用作消毒剂或防腐剂,虽然实际量应根据特定的目标真菌和应用而定,但是本发明的化合物通常以准备保存的消毒溶液或材料的0.5到5重量%、更优选1到3重量%的量使用。为了用于治疗真菌感染,本发明化合物的量,及其混合物中存在的任何其它任选的活性物质,可由本领域技术人员容易地确定,并且将根据若干因素而定,所述因素包括任何任选的另外的活性物质的性质、给药方法、待治疗的疾病以及对象的体重。然而,一般地,本发明的化合物可以组合物的0.01-50重量%、优选1-20重量%的量使用。现在将参考下面的非限制性实施例和附图来描述本发明,在附图中:图1显示了许多本发明的化合物的结构;图2显示了S44HP和从产生化合物1的具有失活的ER5和NysN的突变株得到的DMSO提取物的UV-等值线绘图(UV-isoplots);图3显示了从具有失活的ER5和NysN的突变株的DMSO提取物得到的主要多烯峰的TOF谱。具有m/z=980和1034的峰是内部参考;图4显示得自产生S44HP的菌株GG5073SP(参考株)的DMSO提取物和从产生化合物2的具有失活的ER5和KR17的突变株得到的DMSO提取物的UV-等值线绘图;图5显示从具有失活的ER5和KR17的突变株得到的DMSO提取物的主要多烯峰的TOF谱;图6显示得自产生S44HP的菌株GG5073SP(参考株)的DMSO提取物和从产生化合物3的具有失活的ER5、KR17和NysN的突变株得到的DMSO提取物的UV-等值线绘图;图7显示了从具有失活的ER5、KR17和NysN的突变株得到的DMSO提取物的主要多烯峰的TOF谱。具有m/z=980和1034的峰是内部参考;图8显示得自产生S44HP的菌株GG5073SP(参考株)的DMSO提取物和从产生化合物4的具有失活的ER5和KR15的突变株得到的DMSO提取物的UV-等值线绘图;和图9显示了对化合物1和11进行的体内抗真菌活性试验的结果;图10-16是制备本发明的多种化合物的反应路线;图17显示在播散性念珠菌病的中性粒细胞减少性小鼠模型中,本发明的新型化合物的体内试验的结果。实施例化合物的制备制备了表1中所列的化合物。这些化合物各自的精确的立体化学如图1所示。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="541"/>表1.ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="680"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="679"/>^*作为谷氨酸盐S44HP的合成该化合物如Borgosxa0S.E.等人,Archxa0Microbiol.2006xa0Apr;185(3):165-71中所述制备。化合物1-4的合成化合物1-4通过基因操作,使用在制霉菌素生物合成基因簇中的下列位点特异性突变的组合来制备。(序列-在Brautaset,T.,等人,ChemBiol.2000xa0Jun;7(6):395-403中:化合物1,在ER5+NysN处突变;化合物2,在ER5+KR17处突变;化合物3,在ER5+KR17+NysN处突变;化合物4,在ER5+KR15处突变。使用了在Borgosxa0S.E.等人,Archxa0Microbiol.2006xa0Apr;185(3):165-71中所述的ER5失活载体。由申请人设计和制备了以下的构建物:NysN:用于在nysN中分别引入突变CL346ST和CL346AS的载体pSOK201nysN4.1-CL346ST和pSOK201nysN4.1-CL346AS将重组的λ克隆N95的4.1kbxa0NcoI/XbaI片段(Brautaset,T.,等人,Chemxa0Biol.2000xa0Jun;7(6):395-403)克隆到质粒pLITMUS28的相应位点内。从得到的构建物中用EcoRI/HindIII切除完整的4.1kb的插入片段并将其克隆到pGEM11zf(+)的相应位点内。从得到的质粒,用pGEM11nysN4.1表示,通过使用以下引物对包含NysN活性位点的1.5kb区域进行PCR扩增:conA-1F:5’-ttttgaaTTCTTCAAGCCGATGAGCC-3’(正义),和conA-1R:5’-ttttaagctTGGTCGAACAGGTCCGG-3’(反义)。所述引物已引入EcoRI和HindIII位点(加下划线),其用于将得到的PCR片段克隆到pGEM11zf(+)的相应位点内,得到质粒pGEM11nysN1.5。后一质粒用作位点定向诱变(使用QuickChange试剂盒,Stratagene)的模板,使用以下的诱变寡核苷酸:突变CL346ST:CL346ST-F:5’-CTACGGTGTCCACCAntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="88"/>GGGCCAGAACCTGGTGC-3’CL346ST-R:5’-GCACCAGGTTCTGGCCCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="88"/>TGGTGGACACCGTAG-3’突变CL346AS:CL346AS-F:5’-TCGGCTACGGTGTCCACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="86"/>CTGGGCCAGAACCTGG-3’CL346AS-R:5’-CCAGGTTCTGGCCCAGntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="86"/>GTGGACACCGTAGCCGA-3’在序列中,突变核苷酸以粗体表示,而被引入的新的限制性位点(对于突变CL346ST为SalI;对于突变CL346AS为NheI)加下划线。突变用SalI或NheI限制性分析鉴定并且正确突变的载体的全插入片段通过DNA测序进行检验。从得到的质粒获得的突变的1.3kbFspAI/Bpu1102I片段用于置换质粒pGM11nysN4.1的相应的片段,得到质粒pGM11nysN4.1-CL346ST和pGM11nysN4.1-CL346AS。从后一个构建物,使用EcoRI/HindIII切除包含突变nysN基因的4.1kb插入片段并将其连接到pSOK201的3.1kbxa0EcoRI/HindIII骨架内,得到nysN失活质粒pSOK201nysN4.1-CL346ST和pSOK201nysN4.1-CL346AS。对于在产生化合物1的菌株中的nysN的失活,使用了构建物pSOK201nysN4.1-CL346ST。对于在产生化合物3的菌株中的nysN的失活,使用了构建物pSOK201nysN4.1-CL346AS。KR17:用于在NysJ的KR17内引入突变YA5145FE的载体pKR17m切除了质粒pL98E的4.0kbxa0PmlI/BamHI片段(Brautaset,T.,等人,Chemxa0Biol.2000xa0Jun;7(6):395-403)并将其连接到载体pGEM3zf(+)的HincII/BamHI位点内,得到质粒pBB4.0。通过使用以下的引物,从pBB4.0进行包含KR17活性位点区域的1.5kbxa0DNA片段的PCR扩增:KR17-F:5,-ttttctgCAGGCCGCGGTGCGCGC-3’(正义),和KR17-R:5’-TCCGGCATGGTCCGTGAAACC-3’(反义)。PCR产物用PstI(在引物中加下划线的识别位点)和SacI(在扩增的DNA片段中的识别部位)进行末端消化,并且将1.4kb片段连接到pLITMUS28的相应位点内。所产生的质粒pLIT1.4用作位点定向诱变的模板,使用以下的诱变寡核苷酸:KR17-mut1:5’-GCCCCGGCCAGGGCAACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="82"/>GCCGGCAACACGTTCC-3’KR17-mut2:5’-GGAACGTGTTGCCGGCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="85"/>GTTGCCCTGGCCGGGGC-3’。在序列中,突变核苷酸用粗体表示,而被引入的新的限制性位点加下划线。正确的突变用BstBI消化进行检验,并且突变质粒的全插入片段通过DNA测序进行检验。从所产生的质粒pLIT1.4m中,切除1072bpxa0BclI/AccIII片段并用其置换质粒pBB4.0的相应的片段,得到质粒pBB4.0m。使用EcoRI+HindIII切除pBB4.0m的全4.0插入片段,并与质粒pSOK201的3.0kbxa0EcoRI/HindIII骨架连接在一起,得到KR17失活载体pKR17m。KR15:用于在NysJ的KR15内引入突变YA1888FE的载体pKR15m切除了pL20X的3.6kbxa0KpnI/PmlI片段(Brautaset,T.,等人,ChemBiol.2000xa0Jun;7(6):395-403)并将其连接在pGEM3zf(+)的KpnI/HincII位点内,得到pKP3.6。后一质粒用作1.1kbxa0DNA片段的PCR扩增的模板,使用以下的引物:KR15-F1:5’-ttttgaaTTCCCGACGGCCTCTCCTACC-3’(正义),和KR15-R1:5’-ttttaagCTTGCCGAGTCGGTTGCGC-3’(反义)。将得到的PCR产物用EcoRI/HindIII(限制性位点在引物中加下划线)进行末端消化,并将其连接到pLITMUS28的相应位点内,得到pLIEH1.1。后一质粒充当位点定向诱变的模板,使用以下的诱变寡核苷酸:mutKR15-1F:5’-CCGGGCCAGGCCAACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="84"/>GCCGGCAACACCTTCCTCG-3’mutKR15-1R:5’-CGAGGAAGGTGTTGCCGGCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="84"/>GTTGGCCTGGCCCGG-3’突变的核苷酸以粗体表示,加下划线的部分是被引入的新的BstBI位点。正确的突变用BstBI消化进行检验,并且突变质粒的全插入片段通过DNA测序进行检验。从突变的质粒切除1045bpxa0FspA1/AccIII-片段并用其置换pKP3.6的相应的区域,得到pKP3.6mut。然后使用EcoRI/HindIII切除pKP3.6mut的全3.6kb的插入片段并将其连接于pSOK201的3.2kbxa0EcoRI/HindIII片段,得到KR15失活载体pKR15m。向诺尔斯氏链霉菌株中引入置换型载体:如前所述(Brautaset,T.,等人,Chemxa0Biol.2000xa0Jun;7(6):395-403),所有的被构建的失活载体被转化成大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)ET12567(pUZ8002),并使用所产生的重组株将失活载体结合到诺尔斯氏链霉菌株中;-通过Southern印迹+PCR证实第一交换-选择第二交换候选物(对安普霉素敏感)-通过Southern印迹+PCR对第二交换候选物进行基因表征-正确的第二交换突变株与pNA0的互补(Brautaset等人,2000,Chem.Biol.,7:395-403)。使互补的重组株经历发酵并通过HPLC和MS-TOF分析证实相应分子的产生。化合物1UV等值线绘图S44HP标准品和从具有失活的ER5和NysN的诺尔斯氏链霉菌突变株得到的DMSO提取物示于图2的等值线绘图中。LC-MS等值线绘图:柱:Zorbaxxa0SB-C18xa02.1x100mm,3.5μm(Agilentxa0Technologies)。流动相A:10mM乙酸铵(Riedel-de-ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="43"/>#25006),未调节pH,流动相B:100%乙腈(Rathburn,HPLC级)时间xa0xa0%B0.00xa0xa0276.50xa0xa0657.30xa0xa0657.40xa0xa0xa02712.00xa0xa027流速:0.22mL/min柱温:周围环境温度TOF-MS参数:负API-ES电离干燥气体:10l/min喷雾器压力:40psig干燥气体温度:350°C毛细管电压:3000V碎裂发生器:200VTOF-MS谱TOF-MS谱如图3所示,其中m/z=966、980和1034的峰是内部质量参考。化合物1(C₄₇H₇₅NO₁₅)的理论m/z(负离子)是892.5063。这一m/z以高精确度被观察到并且与七烯的UV-峰良好相关。在化合物1的电离期间水的丧失(1个和2个分子)还分别产生了具有Δm/z=-18和Δm/z=-36的质量峰。通过制备型LC进行纯化在制备型反相柱上进行纯化。制备型方法:柱:Agilentxa0Prep-C18xa050x250mm,10μm(Agilentxa0Technologies)。流动相:10mM乙酸铵(Riedel-de-ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="42"/>#25006),用乙酸(JTxa0Baker#6002)将pH调节4.0,流动相B:100%甲醇(Lab-Scan,HPLC级)时间xa0xa0xa0xa0%B0.00xa0xa0xa0xa0786.00xa0xa0xa0xa0786.20xa0xa0xa0xa010011.00xa0xa0xa0xa010011.20xa0xa0xa0xa078流速:85mL/min柱温:周围环境温度通过制备型LC进行纯化后,化合物1显示为占样品中的多烯大环内酯的>97%,这通过UV和MS数据得以确定。LC-MS方法:柱:Zorbaxxa0Bonus-RPxa02.1x50mm,3.5μm(Agilentxa0Technologies)。流动相A:10mM乙酸铵(Riedel-de-ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="43"/>#25006),用乙酸(JTBakerxa0#6002)将pH调节4.0,流动相B:100%乙腈(Rathburn,HPLC级)时间xa0xa0xa0xa0xa0%B0.00xa0xa0xa0xa0xa02710.00xa0xa0xa0xa05310.10xa0xa0xa0xa02715.00xa0xa0xa0xa027流速:0.3mL/min柱温:周围环境温度对于不含羧基的多烯(特别是化合物1),所述方法还使用用乙酸(JTBakerxa0#6002)将pH调节至7.0的20mM碳酸氢铵(Flukaxa0#09830)作为流动相运行,因为升高的pH使得含和不含羧基可电离基团的多烯之间的分离稍好。MS参数:负API-ES电离干燥气体:12l/min喷雾器压力:35psig干燥气体温度:350°C毛细管电压:3000V化合物2UV等值线绘图菌株GG5073SP(产生S44HP)和具有失活的ER5和KR17结构域的突变株的DMSO提取物如图4中的等值线绘图所示。LC-MS方法和TOF-MS参数:与化合物1的相同。TOF-MS数据TOF-MS谱如图5所示。化合物2(C₄₇H₇₁NO₁₇)的理论m/z(负离子)是920.4649。这一m/z以可接受的精确度(<3ppm误差)被观察到并且与七烯的UV-峰良好相关。通过制备型LC进行纯化在制备型反相柱上进行纯化。制备型方法:柱:Agilentxa0Prep-C18xa050x250mm,10μm(Agilentxa0Technologies)。流动相:10mM乙酸铵(Riedel-de-ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="41"/>#25006),用乙酸(JTxa0Baker#6002)将pH调节4.0,流动相B:100%甲醇(Lab-Scan,HPLC级)时间xa0xa0xa0xa0xa0%B0.00xa0xa0xa0xa0xa07015.00xa0xa0xa0xa07015.20xa0xa0xa0xa010019.00xa0xa0xa0xa010019.20xa0xa0xa0xa07022.00xa0xa0xa0xa070流速:100mL/min柱温:周围环境温度通过制备型LC进行纯化后,化合物2显示为占样品中的多烯大环内酯的>95.2%,这通过UV和MS数据得以确定。LC-MS方法:与化合物1的相同。化合物3UV等值线绘图菌株GG5073SP(产生S44HP)和具有失活的ER5和KR17结构域以及失活的NysN的突变株的DMSO提取物如图6中的等值线绘图所示。LC-MS方法:柱:Zorbaxxa0Bonus-RPxa02.1x50mm,3.5μm(Agilentxa0Technologies)。流动相A:10mM乙酸铵(Riedel-de-ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="43"/>#25006),用乙酸(JTBakerxa0#6002)将pH调节4.0,流动相B:100%乙腈(Rathburn,HPLC级)时间xa0xa0xa0xa0xa0%B0.00xa0xa0xa0xa0xa0276.50xa0xa0xa0xa0xa0657.30xa0xa0xa0xa0xa0657.40xa0xa0xa0xa0xa02712.00xa0xa0xa0xa027流速:0.3mL/min柱温:周围环境温度TOF-MS参数:与化合物1的相同。TOF-MS谱如图7所示,其中m/z=980和1034的峰是内部质量参考。化合物3(C₄₇H₇₃NO₁₅)的理论m/z(负离子)是890.4907。这一m/z以高精确度被观察到(参见质谱)并且与七烯的UV-峰良好相关。在化合物3的电离期间的水的丧失(1个和2个分子)还分别产生具有Δm/z=-18和Δm/z=-36的质量峰。另外,羧基化类似物(在所示的MS谱中具有m/z=920.4644)显示了显著程度的色谱共洗脱。已知羧基化化合物在负MS模式中具有显著更高的电离效率,从而相对定量化不应以所示的MS谱中的信号强度为基准。化合物4UV等值线绘图菌株GG5073SP(产生S44HP)和具有失活的ER5和KR15结构域的突变株的DMSO提取物如图8中的等值线绘图所示。LC-MS方法:与化合物3的相同。化合物5-23的合成一般方法通过在CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)的溶剂系统中,在Merck硅胶60F254板上的TLC监控反应。得到的产物的纯度通过HPLC进行测定并且是80-90%。LCxa010系列的Shimadzuxa0HPLC仪器上的Kromasilxa0100-C18柱(4×250mm,粒度6μm)上,以20μL的注射体积和408nm的波长进行分析型反相HPLC。溶剂系统由pHxa02.6的0.01MH3PO4和乙腈组成。乙腈的比例在1.0mL/分钟的流速下,用30分钟从30%改变到70%。化合物5-16的合成向S44HP(18mg,0.02mmol)和溶解在0.3mL的DMSO中的0.06mmol合适的盐酸胺的混合物中分份加入Et₃N以调节到pHxa08-8.5,然后在15分钟期间加入0.03mmol的PyBOP-试剂。反应混合物在室温下搅拌1小时。随后向反应混合物中加入乙醚(~3mL)得到油性残余物,将其与乙醚(3mL×2)连续振摇。在向该油状物中加入5mL的丙酮后,形成了黄色的酰胺沉淀物。将沉淀物过滤,用丙酮洗涤,然后真空干燥。所有的样品以超过90%的收率获得。这些化合物的分析数据总结在下表2中。化合物17-19的合成将合适的单糖(D-葡萄糖或D-半乳糖)或二糖(乳糖)(0.086mmol)加入到含S44HP(40mg,0.043mmol)的DMF(2mL)的溶液中。将反应混合物在37°C保持20小时,然后将溶液滴加到乙醚(50mL)中。将得到的沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。将得到的黄色沉淀物进行快速色谱纯化(CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1))。收集包含所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入乙醚,然后将黄色的沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。所有的样品以40-45%的收率获得。这些化合物的分析数据总结在下表2中。化合物20的合成向4-N,N-二甲基氨基苯甲醛(0.065mmol)和S44HP(20mg,0.022mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入NaBH₃CN(4.1mg,0.065mmol)。将反应混合物在37°C保持20小时。加入乙醚(10mL)得到油性残余物,将其与乙醚连续地振摇(10mL×2)。在加入丙酮(10mL)后形成黄色的沉淀物。将沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。将得到的固体在柱色谱用Merck硅胶(0.040-0.063mm)上进行快速色谱纯化(CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1))。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩,加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。化合物21和22的合成向N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氨基丙醛(160mg,0.054mmol)和S44HP(100mg,0.011mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入NaBH₃CN(34mg,0.054mmol)。将反应混合物在37°C保持20小时,然后将其滴加到乙醚(200mL)中。将化合物混合物的黄色沉淀物滤出,并通过在柱色谱法用Merck硅胶上(0.040-0.063mm)在线性梯度体系CHCl₃∶MeOH∶HCOOH(3∶1∶0.01)→CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)中进行快速色谱法来分离和纯化单个化合物,得到N-[N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氨基丙基]-S44HP和N,N-二-[N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氨基丙基]-S44HP,为黄色固体。向N-[N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氨基丙基]-S44HP或N,N-二-[N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氨基丙基]-S44HP在DMSO(3mL)的溶液中加入哌啶(0.1mL)。在室温下2小时后,加入乙醚(~7mL)并形成油性残余物,将其与乙醚(7mL×2)连续振摇。加入丙酮(10mL)得到化合物21或化合物22的黄色沉淀物,将其滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。得到的化合物21和22的分析数据总结在下表2中。化合物23的合成向S44HP(100mg,0.11mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液中加入N^α,N^ε-二-(9-芴基甲氧基羰基)-L-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(221mg,0.33mmol)和Et₃N(15.3μl,0.11mmol)。将反应混合物在37°C保持1小时,然后加入H₂O(5mL)。将混合物用正丁醇提取(3×5mL)。将有机级分合并,用0.01Nxa0HCl(1×5mL)和H₂O(3×5mL)洗涤。将溶液浓缩并加入乙醚,得到黄色的沉淀物,将其滤出,用乙醚洗涤并在硅胶上进行快速色谱纯化(CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶4∶0.5∶0.01))。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩,加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。向含分离的黄色固体(30mg)的DMSO(3mL)中加入哌啶(0.1mL)。在室温下2小时后,加入乙醚(~7mL),形成油性残余物,将其与乙醚(7mL×2)连续振摇。加入丙酮(10mL)后得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。表2.化合物5-23的TLC(Rf)、HPLC(Rt)、MALDI质谱和溶解度数据ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="642"/>^*在溶剂体系CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)中在Merck硅胶60F254板上进行TLC^**在LCxa010系列的Shimadzuxa0HPLC仪器上的Kromasilxa0100-C18柱(4×250mm,粒度6μm)上,在20μL的注射体积和408nm的波长下进行HPLC。系统由pHxa02.6的0.01Mxa0H3PO4和乙腈组成。乙腈在1.0mL/分钟的流速下用30分钟从30%变到70%。^#HPLC等强度体系-35%MeCN.^##[M+H]⁺¹水溶解度:+溶于水,±微溶于水,-不溶于水根据上下文所述的合成原则还合成了化合物24到29。另外,基于图10-16中所示的合成规程以及其中的路线和随后的说明,制备了下面的其它化合物。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="612"/>表3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="630"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="632"/>化合物28是化合物48的谷氨酸盐。表4.S44HP和化合物1的衍生物的性质:TLC(Rf)、HPLC(Rt)、MALDI质谱和溶解度数据ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="646"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="647"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="652"/>得到的类似物的用于最初的抗真菌活性试验的纯度是85-95%。^*在以下的溶剂体系中在Merck硅胶60F254板上进行的TLC:I-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1),II-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(7∶1∶0.01∶0.01),III-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶浓NH₄OH(13∶6∶0.7∶0.01),IV-AcOEt∶n-ProOH∶浓NH₄OH(15∶10∶10)。^**在LCxa010系列的Shimadzuxa0HPLC仪器上的Kromasilxa0100-C18柱(4×250mm,粒度6μm)上,在20μL的注射体积和408nm的波长下,进行分析型反相HPLC。溶剂体系构成如下:A-0.2%HCOONH₄pHxa04.5和MeCN,MeCN的比例用30分钟从30%变到70%,B-0.2%HCOONH₄pHxa04.5和MeCN:25→65%,40min.;C-0.2%HCOONH₄xa0pHxa04.5和MeCN,30→90%,30min.,90→90%,10min.;D-等强度体系-35%MeCN。^***盐酸盐。水溶解度:+溶于水,±微溶于水,-不溶于水^#[M+H]⁺¹;^##[M-H₂O+Na]⁺¹另外的S44HP衍生物(化合物30到48)的合成。一般方法在以下的溶剂系统中在Merck硅胶60F254板上通过TLC来监控反应:I-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1),II-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(7∶1∶0.01∶0.01),III-CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶浓NH₄OH(13∶7∶1∶0.1),IV-AcOEt∶n-ProOH∶浓NH₄OH(15∶10∶10)。在LCxa010系列的Shimadzuxa0HPLC仪器上,在Kromasilxa0100-C18柱(4×250mm,粒度6μm)上,在20μL的注射体积和408nm的波长下,进行分析型反相HPLC。溶剂体系构成如下:A-0.2%xa0HCOONH₄xa0pHxa04.5和MeCN,MeCN的比例用30分钟从30%变到70%;B-0.2%HCOONH₄pHxa04.5和MeCN:25→65%,40min.;C-0.2%HCOONH₄xa0pH4.5和MeCN,30→90%,30min.,90→90%,10min.;D-等强度体系-35%xa0MeCN;E-0.01Mxa0H₃PO₄xa0pHxa02.6和MeCN,30→70%,30min.F-0.01Mxa0H₃PO₄xa0pHxa02.6和MeCN,40→80%,30min。S44HP的二修饰衍生物。N-果糖基S44HPxa0N,N-二甲基氨基丙基酰胺(DMAP)、N-果糖基S44HPxa0N-羟基丙基酰胺(HP)或N-果糖基S44HPxa0N,N-二甲基氨基乙基(DMAE)酰胺(分别是化合物30,36,41);N-吡喃塔格糖基S44HPDMAP酰胺(化合物31)或N-吡喃塔格糖基S44HPxa0DMAE酰胺(化合物42)(反应路线1,左侧)。第一步(酰胺化)-S44HPxa0DMAP酰胺(化合物11)、S44HPxa0HP酰胺(化合物12)或S44HPxa0DMAE酰胺(化合物48)。向S44HP(36mg,0.04mmol)和溶解在0.6mL的DMSO中的0.12mmol合适的盐酸胺的混合物中分份加入到Et₃N以调节到pHxa08-8.5,然后在15分钟期间加入0.06mmol的PyBOP-试剂。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后向反应混合物中加入乙醚(~5mL)得到油性残余物,将其与乙醚连续振摇(5mL×2)。向该油状物中加入8mL的丙酮后形成黄色的酰胺沉淀物。将该沉淀物过滤,用丙酮洗涤,然后真空干燥。在Sephadexxa0G-25(Pharmaciaxa0Finexa0Chemicalsxa0AB,Uppsala,Sweden)上进行柱色谱,纯化粗酰胺(HPLC数据显示85-90%的纯度,并含有盐)。使用水过柱。通过HPLC控制级分的纯度,得到标的为通过HPLC测定纯度>92%的合适的S44HP酰胺。第二步(酰胺的Amadori重排):将D-葡萄糖或D-半乳糖(0.086mmol)加入到合适的S44HP酰胺(化合物11、12、48)(0.040mmol)在DMF(2mL)中的溶液中。将反应混合物在37°C保持20小时。然后将反应混合物滴加到乙醚(50mL)中。将得到的沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。将粗化合物(HPLC数据显示85-90%的纯度,并含有盐)在Sephadexxa0G-25(Pharmaciaxa0Finexa0Chemicalsxa0AB,Uppsala,Sweden)上进行柱色谱纯化。使用水过柱。通过TLC、系统IV控制级分的纯度。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入丙酮得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥。化合物41以盐酸盐形式获得。向含化合物41的甲醇溶液中加入含0.1Nxa0HCl的甲醇达到pH~4。加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。S44HP酰胺的N-烷基衍生物的纯度>92%。这些化合物(30、36、41、31、42)的分析数据总结在上表4中。N-(4-N,N-二-甲基氨基苄基)S44HPxa0DMAP酰胺、N-(4-N,N-二-甲基氨基苄基)S44HPxa0HP酰胺或N-(4-N,N-二-甲基氨基苄基)S44HPDMAE酰胺(分别是化合物32、37、43)(反应路线1(图10),右侧)。第一步(酰胺化)。S44HPxa0DMAP酰胺(化合物11)、S44HPxa0HP酰胺(化合物12)或S44HPxa0DMAE酰胺(化合物48)根据上述就化合物30所述(第一步)而获得。第二步(酰胺的还原N-烷基化)。将4-N,N-二甲基氨基苯甲醛(0.065mmol)和合适的S44HP酰胺(化合物11、12或48)(0.022mmol)在DMF(2mL)中的溶液在37°C保持2小时,然后加入NaBH₃CN(4.1mg,0.065mmol)。将反应混合物在37°C保持20小时。加入乙醚(10mL)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(10mL×2)。在加入丙酮(10mL)后形成黄色的沉淀物。将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。使用CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)体系,在Merck硅胶上通过柱色谱纯化包含盐的粗化合物。通过TLC、体系I控制级分的纯度。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入丙酮得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥。合适的S44HP酰胺的N-烷基衍生物的纯度>92%。这些化合物的分析数据总结在上表4中。N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPxa0DMAE酰胺、N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPxa0HP酰胺或N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPxa0DMAP酰胺(分别是化合物39、45、34)(酰胺的N-氨基酰基化,反应路线2(图11,左侧)。向N,N-二甲基甘氨酸(0.04mmol)和合适的S44HPxa0DMAE酰胺(化合物48)、S44HPxa0HP酰胺(化合物12)或S44HPxa0DMAP酰胺(化合物11)(参见反应路线1)(0.02mmol)在0.5mL的DMSO中的混合物中,加入Et₃N以调节到pHxa08,然后在15分钟期间分份加入0.03mmol的PyBOP-试剂。将反应混合物在室温下搅拌1小时。随后向反应混合物中加入乙醚(~3mL)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(3mL×2)。向该油状物中加入5mL的丙酮后形成黄色的酰胺沉淀物。将沉淀物滤出,用丙酮洗涤然后真空干燥,得到N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPDMAE酰胺、N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPxa0HP酰胺或N-(N,N-二甲基甘氨酰基)S44HPxa0DMAP酰胺(化合物39、45、34)。这些化合物的分析数据总结在上表4中。N-(N-L-赖氨酰基)S44HPxa0HP酰胺和N-(N-L-赖氨酰基)S44HPDMAE酰胺(分别是化合物38和44)(反应路线2,右侧)。第一步:(N-[N-Fmoc-氨基]酰基化)--N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HP。向冷却到~+5°C的N^α,N^ε-二-(9-芴基甲氧基羰基)-L-赖氨酸(180mg,0.33mmol)、N-羟基苯并三唑(54mg,0.4mmol)在无水DMF(1.2mL)中的溶液中加入DCC(62mg,0.3mmol),将反应混合物在~+5°C搅拌1小时。将DCU的残余物滤出,将得到的洗脱液加入到含S44HP(184mg,0.2mmol)的DMF(1.0)mL)中。然后向反应混合物中在10分钟期间在搅拌下滴加(i-Pro)₂EtN(0.1mL,0.81mmol)。将反应混合物在体系中于TLC控制下室温搅拌2小时,所述体系为:CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(6∶1∶0.01∶0.02),然后加入20mL的乙醚。将得到的沉淀物滤出,用乙醚∶丙酮的混合物洗涤(1∶1,10ml×3)并真空干燥,得到202mg的黄色粉末。将粗化合物在Merck硅胶上进行柱色谱纯化,使用的体系为:CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(9∶1∶0.01∶0.02→7∶1∶0.01∶0.02)。在体系II中通过TLC控制级分的纯度。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入丙酮得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥,得到60mg的纯的N-[N^α,N^ε-二-(9-芴基甲氧基羰基)-L-赖氨酰基]S44HP(>96%,HPLC,Rt=22.80,体系B)。MALDI质谱。C₈₃H₁₀₅N₃O₂₂的实测值1500.542[M-H₂O+Na]⁺¹,计算值1495.72(精确质量)。第二步(N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基的酰胺化)S44HP-N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HPxa0HP酰胺或N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HPxa0DMAE酰胺:向N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HP(0.02mmol)和溶解在0.3mL的DMSO中的0.06mmol的3-羟基丙基胺盐酸盐或4-(N,N-二甲基氨基)丙基胺二盐酸盐的混合物中,分份加入Et₃N以调节到pHxa07-7.5然后在15分钟期间加入0.03mmol的PyBOP-试剂。将反应混合物在室温下,在体系CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶浓NH₄OH(5∶1∶0.01∶0.01)中于TLC控制下搅拌1小时。随后向反应混合物中加入乙醚(~3mL)得到油性残余物,将其用乙醚连续振摇(3mL×2)。向该油状物中加入5mL的丙酮后,形成了黄色的酰胺沉淀物。将该沉淀物过滤,用丙酮洗涤,然后真空干燥,得到合适的N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HPxa0HP-酰胺或(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HP-DMAE酰胺,HPLC数据(分别是Rt=21.43(C)和20.39(B))显示纯度为~90%。在体系CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶浓NH₄OH(5∶1∶0.01∶0.01)中,TLC数据分别是Rf=0.47和Rf=0.43,。第三步(除去Fmoc)。向溶解在DMSO(3mL)中的合适的N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HP酰胺(30mg)中加入哌啶(0.1mL)。在室温下2小时后,加入乙醚(~7mL),形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(7mL×2)。加入丙酮(10mL)后得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。化合物44作为盐酸盐被获得。向化合物44在甲醇中的溶液中加入含0.1Nxa0HCl的甲醇,至pH~4。加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。这两个化合物的分析数据总结在上表4中N-(4-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAP酰胺、N-(4-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0HP酰胺、N-(4-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAE酰胺(分别是化合物35、40、46)(反应路线3,图12,左侧)。第一步(N-[4-Fmoc-氨基甲基]苯甲酰基化)-N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HP:在就化合物38所述的条件下(第一步)获得衍生物。向4-N-Fmoc-氨基甲基苯甲酸(80mg,0.022mmol)和S44HP(100mg,0.11mmol)在DMSO(3mL)中的溶液中,加入Et₃N以调节到pH7,并加入PyBOP(90mg,0.165mmol)。将反应混合物在室温保持20小时,然后滴加乙醚(200mL)。将黄色的沉淀物滤出并在体系CHCl₃∶MeOH∶HCOOH(3∶1∶0.01)中在柱色谱用Merck硅胶(0.040-0.063mm)上进行柱色谱纯化,得到N-(4-N-Fmoc-氨基甲基)苯甲酰基S44HP(化合物47),HPLC数据(Rt=18.18,体系B)显示纯度~95%。TLC(Rf=0.61,I)第二步(N-[4-Fmoc-氨基甲基]苯甲酰基S44HP的酰胺化)-N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAP酰胺、N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0HP酰胺或N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAE酰胺。在就化合物38所述的条件下(第二步),从N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HP和合适的DMAP胺、HP胺或DMAE胺开始并使用PyBOP试剂,获得衍生物。将反应混合物搅拌4小时。HPLC数据显示纯度为~85-93%:N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAP酰胺(Rt=15.88,B;Rf=0.25,I),N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0HP酰胺(化合物12)(Rt=17.14,B;Rf=0.60,I),或N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAE酰胺(Rt=15.95,B;Rf=0.24,I)。第三步(除去Fmoc)。在就化合物38所述的条件下(第三步),从N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0DMAP酰胺、N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPxa0HP酰胺或N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HPDMAE酰胺开始,获得衍生物。这三个化合物的分析数据总结在下表2中。N-L-赖氨酰基S44HPxa0DMAP-酰胺(化合物33)(反应路线3,右侧)。第一步(酰胺化)-S44HPxa0DMAP-酰胺(化合物11):就化合物33所述(反应路线1,左侧),获得S44HPxa0DMAP酰胺。纯度是~90%(HPLC)。第二步(DMAP酰胺的N-[N-Fmoc-氨基]酰基化)-N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HPxa0DMAP-酰胺:向S44HPxa0DMAP酰胺(0.02mmol)在DMSO(0.5mL)中的溶液中加入N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酸(0.04mmol)和Et₃N(pHxa07-7.5),然后在15分钟期间加入0.03mmol的PyBOP-试剂。将反应混合物在室温下搅拌1小时。随后向反应混合物中加入乙醚(~3mL),形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(3mL×2)。在向该油状物中加入5mL的丙酮后,形成黄色的酰胺沉淀物。将该沉淀物过滤,用丙酮洗涤,然后真空干燥,得到N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)S44HPxa0DMAP酰胺,HPL数据(Rt=22.01,体系B)显示纯度为~95%。第三步(除去Fmoc)。在就化合物38所述的条件下(第三步),从N-(N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酰基)DMAP酰胺开始获得衍生物。这两个化合物的分析数据总结在上表4中。S44HP的单修饰衍生物N-(4-氨基甲基苯甲酰基)S44HP(化合物47)(参见反应路线4,图13,除去Fmoc)在就化合物38所述的条件下(第三步),从N-(4-Fmoc-氨基甲基苯甲酰基)S44HP(根据反应路线3第一步获得)开始而获得。这两个化合物的分析数据总结在上表4中。N,N-二甲基氨基乙基(DMAE)S44HP酰胺(化合物48)(备选方法,反应路线5,图14)。第一步(引入Fmoc)。N-Fmoc-S44HP。向搅拌过的500mg(0.5mmol)的粗S44HP在6mL的DMF∶MeOH(5∶1)中的溶液中分份加入0.057mL(0.65mmol)的吡啶和360mg(1.0mmol)的FmocOSu。将反应混合物在室温下搅拌4小时。随后向反应混合物中加入乙醚(20mL),形成黄色的N-Fmoc-S44HP沉淀物。将该沉淀物过滤器,用乙醚洗涤并干燥。将粗N-Fmoc-S44HP在体系CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.05)中在Merck硅胶上进行柱色谱纯化,得到~30%的N-Fmoc-S44HP,通过HPLC(Rt=20.49,体系:0.01Mxa0H₃PO₄xa0pHxa02.6和MeCN,40→80%,30min)测得纯度为94%。TLCxa00.39(III)。第二步(酰胺化)N-Fmoc-S44HPxa0DMAE酰胺。向搅拌过的115mg(0.10mmol)的N-Fmoc-S44HP在2mlxa0DMSO中的溶液中,加入37mg(0.30mmol)的N,N-二甲基氨基乙基胺盐酸盐和Et₃N以调节到pH7-7.5,并分份加入78mg(0.15mmol)PyBOP;通过加入Et₃N保持反应混合物的pH为7-7.5。将反应混合物在室温下搅拌1小时。随后向反应混合物中加入乙醚(5mL)得到油性残余物,将其与乙醚连续振摇(5mL)。加入丙酮(10mL)形成黄色的沉淀物,将该沉淀物滤去,用丙酮洗涤并干燥,得到N-Fmoc-S44HPxa0DMAE酰胺,HPLC数据(Rt=14.50,体系A)显示纯度为~92%。第三步(除去Fmoc)。在就化合物38所述的条件下(第三步),从N-Fmoc-S44HPxa0DMAE酰胺开始获得衍生物-(化合物48)。该化合物的分析数据总结在上表4中。纯化合物1:从粗化合物1的样品开始进行化合物1的纯化(反应路线6,图15)。第一步(引入Fmoc和纯化)。N-Fmoc-化合物1。向搅拌过的2000mg(2.0mmol)的粗化合物1(含化合物1-81.5%,S44HP-8.27%和未知杂质~10%,根据HPLC数据显示,体系B)在40mLxa0DMSO中的溶液中加入Et₃N以调节到pHxa07-7.5,然后分份加入1400mg(4.0mmol)的FmocOSu;通过加入Et₃N保持反应混合物的pH为7-7.5。将反应混合物在室温下搅拌2小时。随后向反应混合物中加入乙醚(200mL)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(150mL×3)。向该残余物乙醚(50mL)中加入50mL丙酮后形成黄色的沉淀物。将该沉淀物过滤并用乙醚洗涤并真空干燥,得到2200mg的粗N-Fmoc-化合物1,其在体系CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶25%NH₄OH(13∶6∶1∶0.05)中在Merck硅胶上进行柱色谱纯化,得到650mg(~30%)的N-Fmoc-化合物1,HPLC(Rt=18.44,体系C)显示纯度为86%。第二步(除去Fmoc)。在15°C向溶解在DMSO(60mL)中的Fmoc-化合物1(400mg)中加入哌啶(0.2mL)。在15°C历时2小时后,加入乙醚(~50mL);形成油性残余物并将其与乙醚连续振摇(50mL×3)。加入丙酮(10mL)和乙醚(20mL)后得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥,得到300mg的纯化合物1。一部分纯化合物1的盐酸盐形式用于HPLC分析。向化合物1(碱)在甲醇中的溶液中加入含0.1Nxa0HCl的甲醇以达到pH~4。加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥,HPLC数据(盐酸盐,Rt=11.37,体系A)显示纯度为92.1%。化合物1的单修饰衍生物(反应路线7,图16)。N-吡喃果糖基-化合物1(化合物49)(Amadori重排):将D-葡萄糖(0.086mmol)加入到化合物1(0.040mmol)在DMF(2mL)中的溶液中。将反应混合物在37°C保持20小时。然后将反应混合物滴加到乙醚(50mL)中。将得到的沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。将粗产物(HPLC数据显示为85-90%的纯度,并含有盐)在SephadexG-25(Pharmaciaxa0Finexa0Chemicalsxa0AB,Uppsala,Sweden)上进行柱色谱纯化。使用水过柱。通过TLC体系IV控制级分的纯度。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入丙酮得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥。得到的化合物41为盐酸盐。向化合物49在甲醇中的溶液中加入含0.1Nxa0HCl的甲醇达到pH~4。加入乙醚得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。N-吡喃果糖基-化合物1(化合物49)的分析数据总结在下表2中。N-(4-N,N-二-甲基氨基苄基)化合物1(化合物50)(还原N-烷基化)。将4-N,N-二甲基氨基苯甲醛(0.065mmol)和化合物1(0.022mmol)在DMF(2mL)中的溶液在37°C保持2小时,然后加入NaBH₃CN(4.1mg,0.065mmol)。将反应混合物在37°C保持20小时。加入乙醚(10mL)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(10mL×2)。加入丙酮(10mL)后形成黄色的沉淀物。将沉淀物滤出,用乙醚洗涤并干燥。将含有盐的粗产物在Merck硅胶上使用体系CHCl3∶MeOH∶H2O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)进行柱色谱纯化。通过TLC体系I控制级分的纯度。收集含有所需化合物的级分并将溶液浓缩。加入丙酮得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥。N-(4-N,N-二-甲基氨基苄基)化合物1(化合物50)的分析数据总结在上表4中。N-L-赖氨酰基-化合物1(化合物51)第一步(N-[N-Fmoc-氨基]酰基化)。将化合物1(50mg,0.055mmo1)在无水DMF(1mL)中的溶液在10°C冷却,然后加入Et₃N(7.5μl,0.055mmo1)和N^α,N^ε-二-Fmoc-L-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(57mg,0.083mmol)。将反应混合物在该温度下搅拌1小时。通过在CHCl₃∶MeOH(6∶1)的溶剂体系中由TLC控制反应进程。向反应混合物中加入乙醚(~5ml)形成黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤,真空干燥并在硅胶(体系CHCl₃-MeOH,MeOH梯度0→10%)上进行柱色谱纯化。收集含有所需化合物的级分,将溶液浓缩并加入乙醚,得到黄色的沉淀物,将其滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。TLC:Rf=0.6(CHCl₃-MeOHxa06∶1).HPLC:Rt=13.08(0.2%HCOONH₄xa0pHxa04.5和MeCN:75→90%,20min,90→90%,10min)第二步(除去Fmoc)。向含有分离的黄色固体(22mg,0.015mmo1)的DMSO/MeOH10∶1(1mL)中加入哌啶(4.5μl,0.045mmo1)。在室温下搅拌30分钟后,加入乙醚(~3mL);形成油性残余物并将其与乙醚连续振摇(~3mL)。加入丙酮(2mL)得到黄色的沉淀物,将该沉淀物滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。N-L-赖氨酰基-化合物1(化合物51)的分析数据总结在上表4中。N,N-二-(3-氨基丙基)-化合物1(化合物52)第一步(还原N-烷基化)向N-Fmoc-3-氨基丙醛(160mg,0.054mmo1)和化合物1(100mg,0.011mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入NaBH₃CN(34mg,0.054mmo1)。将反应混合物在37°C保持20小时,然后将其滴加到乙醚(200mL)中。将黄色的沉淀物滤出并在柱色谱用Merck硅胶(0.040-0.063mm)上、在线性梯度体系CHCl₃∶MeOH∶HCOOH(3∶1∶0.01)→CHCl₃∶MeOH∶H₂O∶HCOOH(13∶6∶1∶0.1)中进行快速色谱纯化,得到黄色沉淀物N,N-二-(N-Fmoc-3-氨基丙基)化合物1。HPLC数据:Rt=27.43(C)第二步(除去Fmoc)。向N,N-二-[3-(N-Fmoc)-氨基丙基]-S44HP在DMSO(3mL)中的溶液中加入哌啶(0.1mL)。在室温下2小时后,加入乙醚(~7mL)并形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(7mL×2)。加入丙酮(10mL)得到黄色的沉淀物,将其滤出,用乙醚洗涤并真空干燥。N,N-二-(3-氨基丙基)化合物1(化合物52)的分析数据总结在上表4中。化合物1的盐L-天冬氨酸盐(55),化合物1L-谷氨酸盐(29),D-谷氨酸盐(54)将化合物1(13mg,0.015mmol)溶解在0.2ml的DMSO中,然后加入相应的氨基酸(0.015mmol)在0.1ml水中的溶液。将反应混合物在室温下保持15分钟。向反应混合物中加入乙醚(~2μml)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(2ml×2)。向该油状物中加入3ml丙酮后形成黄色的盐沉淀物。将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤,然后真空干燥。甲磺酸盐(56),二氯乙酸盐(57)将相应的酸(0.015mmol)溶解在0.1ml的DMSO中,然后将其加入到化合物1(13mg,0.015mmol)在0.1ml的DMSO的溶液中。将反应混合物在室温保持5分钟。向该反应混合物中加入乙醚(~2ml)形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(2ml×2)。向该油状物中加入3ml的丙酮,形成黄色的盐沉淀物。将该沉淀物滤出,用丙酮洗涤,然后真空干燥。化合物1盐酸盐(53)向化合物1(13mg,0.015mmol)在0.2ml的DMSO中的溶液中加入0.1Nxa0HCl的水溶液0.15ml(0.015mmol)。将反应混合物在室温保持5分钟。向该反应混合物中加入乙醚(~2ml)后形成油性残余物,将其与乙醚连续振摇(2ml×2)。向该油状物中加入3ml丙酮,形成黄色的盐沉淀物。将沉淀物滤出,用丙酮洗涤并真空干燥。所有样品以约90%的收率获得并可溶于水。抗真菌活性和毒性的确定抗真菌敏感性研究(1)酵母和丝状真菌(霉菌)的抗真菌敏感性试验相应地使用在NCCLS文件M27-A[Referencexa0methodxa0forxa0Brothxa0Dilutionxa0AntifungalSusceptabilityxa0Testingxa0ofxa0Yeasts,ISBNxa01-56238-328-0,Pennsylvania,1997]和M38-A[Referencexa0methodxa0forxa0Brothxa0Dilutionxa0Antifungalxa0SusceptabilityTestingxa0ofxa0Filamentousxa0Fungi:Approvedxa0Standard,ISBNxa01-56238-470-8,Pennsylvania,2002]所述的肉汤微量稀释法来测定。培养基和缓冲液。在研究中,使用含有L-谷氨酰胺和酚红、不含碳酸氢钠的培养基RPMIxa01640,该培养基补充有0.2%葡萄糖(ICNBiomedicalsxa0Inc.,Ohio,USA),用0.165M吗啉丙烷磺酸(MOPS;ACROSxa0ORGANICS,Newxa0Jersey,USA)缓冲,pHxa07.0。抗真菌剂。将化合物最初以1600μg/mL的起始浓度溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。在相同的溶剂中从储备溶液制备一系列稀释物(1600到3.13μg/mL)。然后将这些DMSO溶液在试验培养基中稀释50倍(首先稀释10倍,然后稀释5倍)。最后,当接种时,将它们稀释2倍,这使最终的溶剂浓度降低到1%(抗真菌剂的最终浓度是16-0.13μg/mL)。在临用前制备所述溶液。有机体。用于敏感性试验的有机体是:白色假丝酵母(Candidaalbicans)ATCCxa014053,土生隐球酵母(Cryptococcusxa0humicolus)ATCC9949,黑曲霉(Aspergillusxa0niger)ATCCxa016404和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)VKMxa0F-140(=CMI,IMIxa090473)。将有机体储存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面上并位于-70°C的50%甘油溶液中。为了短期储存,将储用培养物在4°C的琼脂斜面上储存。将酵母的培养物在沙保氏葡萄糖(SAB)琼脂上进行继代培养并在35°C下温育24小时(白色假丝酵母)或在25°C温育48小时(土生隐球酵母),以获得新生长的纯培养物。将霉菌的培养物在马铃薯葡萄糖琼脂上继代培养并在35°C温育7天(黑曲霉)或在35°C温育2天然后在25°C温育5天(尖孢镰刀菌)以确保最大的孢子形成。接种物制备。对于酵母,通过将培养物集落悬浮在无菌的0.85%盐水中制备起始接种物。将得到的悬浮液涡流并用分光光度计在530nm处进行调节以匹配0.5马克法兰氏(McFarland)浊度(1×10⁶到5×10⁶CFU/mL)。将储备酵母悬浮液用培养基进行1∶1000稀释以获得两倍的供试接种物(1×10³到5×10³CFU/mL)。对于霉菌,通过用无菌的0.85%盐水覆盖成熟真菌集落并轻轻地刮取来制备储备悬浮液。将1%(v/v)的润湿剂吐温20加入到盐水中用于制备曲霉接种物。最后,将悬浮液涡流15秒以破碎细胞团,然后过滤通过四层消毒纱布。在530nm测量分生孢子的孢子悬浮液的密度,并就黑曲霉而言调节到0.09-0.11,就尖孢镰刀菌而言调节到0.15-0.17。将这些悬浮液用标准培养基进行1∶50稀释。1∶50接种物稀释物相当于所需的约0.4×10⁴到5×10⁴CFU/mL密度的2倍。通过将接种物的稀释物铺板在沙氏(Sabouraud)葡萄糖琼脂上以测定每毫升的CFU存活数,来进行接种物的定量。微量稀释技术使用无菌的96孔平底微量滴定板用于试验。将100μl的经稀释的接种物分配在每个微量稀释孔中,所述微量稀释孔含有100μl的化合物双倍稀释物。包括不含药物和不含酵母/霉菌的对照。将微量稀释托盘在无搅拌下在35°C温育(白色假丝酵母和霉菌)或在25°C(土生隐球酵母)温育,并观察可见生长的存在或不存在。使用以下等级对每个孔给出0-4的数字得分:0=光学澄清或不存在生长,1=轻微生长(生长对照的25%),2=生长显著减少(生长对照的50%),3=生长的轻微减少(生长对照的75%),4=生长不减少。在48小时读取最小抑菌浓度(MIC)。每个供试化合物的MIC被定义为防止有机体的任何可见生长(生长得分=0)的抗真菌剂的最低浓度。在一些情况下,为了阐明在所述试剂之间的轻微差异,将霉菌的MIC另外定义为以生长得分=1(生长对照的25%)作为最低浓度。结果示于下表5中。表5.化合物的抗真菌活性ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="638"/>^*MIC被测量为是防止任何可见生长的抗真菌剂的最低浓度。实验结果是可重现的。在得到的数据完全重合的情况中,MIC表示为单一数字。结果表明,本发明的化合物具有抗真菌活性。更具体地说,这些试验提示了许多的制霉菌素衍生物具有可与两性霉素B和S44HP相比的抗真菌活性(例如化合物1、9、11、12、13、14和22)。抗真菌敏感性研究(2)另外还考察了几个制霉菌素衍生物的抗真菌活性。在研究(1)中所用的方法是在国际上认可的用于试验抗真菌活性的方法,但是其不是很敏感,因此不容易区别具有可比较活性的化合物。因此在经过设计而更敏感的方法中测定了许多制霉菌素衍生物的抗真菌活性。进一步试验多烯大环内酯生物活性所用的供试有机体是白色假丝酵母ATCCxa010231,其在不含NaCl(具有1000cfu/孔的接种物)的120ml的标准M19培养基和30ml的经稀释的多烯大环内酯样品中生长。将抗生素在MeOH中进行系列稀释,确保浓度范围产生的结果范围从供试有机体的完全生长抑制到无抑制变化。含有抗生素稀释物的供试有机体培养物在96孔微量滴定板中在无振摇下在30°C温育,并在12、14和16小时后,在SpectraMaxxa0Plus微量滴定板读板器上测量用OD₄₉₀表示的生长。将OD相对于抗生素浓度进行绘图,并且从回归曲线估算在50%生长抑制下的MIC₅₀。结果示于下表6中。表6xa0xa0化合物
xa0xa0MIC₅₀(μg/mL)
xa0xa0AmB
xa0xa00.12
xa0xa0S44HP
xa0xa00.12
xa0xa01
xa0xa00.07
xa0xa09
xa0xa00.13
xa0xa011
xa0xa00.12
xa0xa012
xa0xa00.14
xa0xa015
xa0xa00.20
xa0xa022
xa0xa00.07
结果证实了,本发明的许多的制霉菌素类似物实际上具有与两性霉素B和S44HP二者可比较的改善的抗真菌活性。化合物1盐的抗真菌活性(表7)试验了以下的水溶性盐。化合物1盐酸盐(53),化合物1L-谷氨酸盐(29),化合物1D-谷氨酸盐(54)化合物1L-天冬氨酸盐(55),化合物1二氯乙酸盐(57)表7ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="623"/>化合物1L-谷氨酸盐(29)是活性最高的化合物1的盐。化合物衍生物的抗真菌活性(表8和9)表8xa0xa0化合物50
xa0xa0对-二甲基氨基苄基-化合物1
xa0xa0化合物51
xa0xa0N-(L-赖氨酰基)-化合物1
ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="639"/>化合物51是这一系列中的活性最高的衍生物,其抗真菌活性稍高于母体抗生素。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="386"/>体外毒性研究在2和5μg/mL和在25μM下试验了多种制霉菌素衍生物的毒性。将化合物以5mg/mL溶解在DMSO中并在DMSO中制备了具有不同浓度的0.1mL样品。将样品与含有2.5%马血的0.9mLxa0PBS缓冲液(PBS-HB;保持在冰上)混合并在37°C在无搅拌下温育30分钟。通过在5000rpm离心5分钟使细胞沉淀并通过测量OD₅₄₅来评价溶血作用。100%的溶血被定义为从2.5%马血在蒸馏水中的悬浮液获得的OD₅₄₅值。结果示于下表10-12中。表10.在2和5μg/mL的抗生素的作用下人血红细胞的溶血(M±SE,%)。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="645"/>表11.在5μg/mL的抗生素的作用下红细胞的溶血(M±SEM,%)。xa0xa0血样#

xa0xa0Ampxa0B

xa0xa0S44HP
xa0xa0(92%)
xa0xa07

xa0xa015

xa0xa011

xa0xa012

xa0xa0DMS0

xa0xa01
xa0xa039
xa0xa073
xa0xa05.8
xa0xa02.8
xa0xa03
xa0xa05
xa0xa01.4
xa0xa02
xa0xa038
xa0xa064
xa0xa05.0
xa0xa02.4
xa0xa03.4
xa0xa04.3
xa0xa02.2
xa0xa03
xa0xa042
xa0xa056
xa0xa05.0
xa0xa02.7
xa0xa03.3
xa0xa04.0
xa0xa01.5
xa0xa0均值±
xa0xa0SE
xa0xa039.7±
xa0xa01.2
xa0xa064.3±
xa0xa04.9
xa0xa05.2±
xa0xa00.2
xa0xa02.6±
xa0xa00.1
xa0xa03.2±0.1

xa0xa04.4±
xa0xa00.3
xa0xa01.7±0.25

表12.在25μM的抗生素的作用下红细胞的溶血(M±SEM,%)。xa0xa0血样#
xa0xa05
xa0xa06
xa0xa07
xa0xa09
xa0xa017
xa0xa018

xa0xa02
xa0xa02
xa0xa00.9




xa0xa01.8
xa0xa02.4





xa0xa02.1
xa0xa03.3
xa0xa01.9

xa0xa04.8
xa0xa05.3

xa0xa01.0
xa0xa07
xa0xa01.9
xa0xa012.2



xa0xa01
xa0xa03.7
xa0xa01.7
xa0xa018.0
xa0xa01.7
xa0xa03.0

xa0xa01.9
xa0xa04.3
xa0xa01.3
xa0xa016.7
xa0xa01.7
xa0xa03.2



xa0xa01.9
xa0xa022.4
xa0xa02.1
xa0xa09.7

xa0xa01.3
xa0xa03.2
xa0xa01.0
xa0xa025
xa0xa00.8
xa0xa01.0




xa0xa016.2
xa0xa03.3
xa0xa01.5
xa0xa0均值±S.E.M.
xa0xa01.6±0.2
xa0xa03.7±0.6
xa0xa01.5±0.17
xa0xa018.4±1.9
xa0xa02.4±0.6
xa0xa03.9±1.3
xa0xa0N
xa0xa07
xa0xa07
xa0xa07
xa0xa06
xa0xa06
xa0xa06
xa0xa0P
xa0xa0<0.001
xa0xa0<0.01
xa0xa0<0.001
xa0xa0<0.001
xa0xa0<0.001
xa0xa0<0.05
结果显示,本发明的化合物的毒性显著低于S44HP或两性霉素B。这是非常有利的,因为本发明的化合物因此可以更高的量使用而无副作用。化合物1和11等的体内试验动物。使用了第一代杂交雄性小鼠(C57Bl/6xDBA/2)F1xa0B6D2F1,重20-22g,来源于Russianxa0Academiesxa0ofxa0Medicalxa0Science(RAMS)的中心饲养场′′Kryukovo′′。将动物饲养在生态饲养场的塑料笼(具有硬木垫,处于环境受控条件下:24±1°C,12/12小时光照/黑暗周期)中,粒状饲料的标准饮食,方便地获得饮用水(随意)。在2周检疫期后,在实验工作中使用健康的动物。感染剂。使用白色假丝酵母(14053ATCC株)。抗真菌剂。“临时(exxa0temporae)”制备化合物1和11(等)的溶液并保存在黑色玻璃小瓶中以免照光。如下制备溶液:将干抗生素物质(5mg)与干脱氧胆酸钠(4.1mg)在无菌的玻璃小瓶中混合。向该混合物中加入10mL的磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄-1.59g;Na₂HPO₄-0.96g;H₂O-至100mL),并使得该悬浮液立刻经历剧烈振摇10分钟,直到形成均匀的悬浮液。将得到的悬浮液(2mL)置于新的无菌玻璃小瓶中,加入6mL的5%的中性无菌葡萄糖溶液,并将得到的溶液(0.125mg/mL)用于静脉内给药。还以同样的方法制备了两性霉素B和S44HP的制剂。急性毒性测定了化合物1和11(等)以及两性霉素B和S44HP的急性毒性。在制备了溶液后,在1-1.5小时内将抗生素制剂各自注射进小鼠的尾静脉内。注射速度每分钟不超过0.5毫升/分钟。每种抗生素使用导致0%到100%致死率的剂量范围和最少三个中间剂量。将动物随机分组,每组含6只小鼠。表征毒性的剂量MTD和LD₅₀使用“概率单位分析”方法,根据Litchfield-Wilcoxon(Jxa0Pharmacolxa0Expxa0Therxa096:99),通过统计分析程序“StatPlus-3.5.0.-2005”进行计算。结果示于下表13中。表13.急性毒性xa0xa0化合物
xa0xa0LD₅₀(mg/kg)
xa0xa0MTD(mg/kg)
xa0xa0两性霉素B
xa0xa02.8
xa0xa02.01
xa0xa0S44HP
xa0xa02.05
xa0xa00.64
xa0xa01
xa0xa015.4
xa0xa07.8
xa0xa011
xa0xa016.4
xa0xa011.9
xa0xa029
xa0xa017.8
xa0xa011.0
xa0xa051
xa0xa05.3
xa0xa04.48
xa0xa041
xa0xa038.6
xa0xa021.2
xa0xa048
xa0xa032.2
xa0xa025.9
xa0xa025
xa0xa050.8
xa0xa042.8
xa0xa026
xa0xa050.0
xa0xa043.1
xa0xa027
xa0xa020.6
xa0xa010.8
xa0xa028
xa0xa022.1
xa0xa014.7
体内抗真菌活性将动物以1.0百万个CFU/小鼠(0.1ml体积)的剂量,静脉内感染白色假丝酵母。在感染后30分钟,将在0.2mL体积内的不同剂量抗真菌剂静脉内引入到小鼠中(速率为0.2mL/30秒)。每个剂量每天给予,持续4天,包括感染当天(第0、1、2和3天)。作为对照,存在未经处理的小鼠组(以同样的方法用白色假丝酵母进行感染)。还存在未感染动物的“安慰剂”组,它们被静脉内给予(与抗真菌剂制剂体积相同)0.2mL的溶剂(磷酸盐缓冲液+5%葡萄糖(1∶1))。在任何“安慰剂”组中未鉴定到活性。在未感染的动物中也未曾发现白色假丝酵母。在实验的第5天,将小鼠称重并通过颈错位无痛苦处死。然后,在无菌条件下,通过对肾的匀浆进行活菌计数来测定每只小鼠的白色假丝酵母负荷。将肾无菌地取出并称重,然后在瓷研钵中用无菌金刚砂捣碎。制备所得到的悬浮液的稀释物并播种在具有沙氏琼脂的陪替氏培养皿上,在35°C温育24小时。然后计数所形成的白色假丝酵母集落,并根据1g的肾组织为基准计算它们的量。使用Microsoftxa0Officexa0Excelxa02003进行统计分析。通过学生t-标准比较具有P≤0.05的显著差异。结果示于下表14和图9中。表14.ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="727"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="659"/>在小鼠念珠菌病脓毒病模型上进行的化合物29、51、41、48的比活性研究动物。在实验中,使用第一代杂交雌性小鼠(C57Bl/6xDBA/2)F1(B6D2F1),重18-20g,来源于Russianxa0Academiesxa0ofMedicalxa0Science(RAMS)的中心饲养场′′Kryukovo′′。将动物饲养在生态饲养场的塑料笼(具有硬木垫,处于环境受控条件下:24±1°C,12/12小时光照/黑暗周期)中,粒状饲料的标准饮食,并方便摄取饮用水(随意)。在2周检疫期后,在实验工作中使用健康的动物。作为感染剂,使用白色假丝酵母(14053ATCC株)。供试制剂是化合物29、51、41、48。比较用制剂是两性霉素B(纯的)。通过用户具体说明的技术,临时制备供试制剂的溶液。实验陈述将动物以3只小鼠分笼,并以1,0百万个CFU/小鼠的剂量在0,1ml的体积内进行培养物白色假丝酵母的静脉内感染。有必要注意,在所有实验中,白色假丝酵母的剂量保持恒定。在感染后30分钟,在相应的剂量下在0.2ml体积内(速率0.2ml/30秒)对小鼠进行第一次静脉内引入供试制剂。用如下的方式设计实验,即每个实验一个剂量(对使用两性霉素B和供试制剂均如此),每个剂量每天被给予,持续四天,从感染当天算起(第0、1、2和3天)。在各实验中,存在用白色假丝酵母感染的未经处理的组。还存在完好(未感染)的“安慰剂”动物组,它们被静脉内(与医药制剂体积相同)注射0.2mL的溶剂(磷酸盐缓冲液+5%葡萄糖(1∶1))。“安慰剂”的活性数据显示无任何活性。在未感染的动物中未曾发现白色假丝酵母。在攻击后的实验的第5天,将小鼠称重并通过颈错位无痛苦处死。然后,在无菌条件下,通过对肾匀浆进行活菌计数来测定白色假丝酵母负荷。在无菌条件下取出肾并称重,在瓷研钵中用无菌金刚砂捣碎,对得到的悬浮液进行稀释并播种在具有沙氏琼脂的陪替氏培养皿上,在35°C的温度下温育48小时,然后对形成的白色假丝酵母集落进行计数,并根据1g的肾组织重新计算它们的量。首次稀释度是10^-1。在这一培养下得到的0结果被采纳为是5CFU/g。对于评价被考察的制剂的基本标准,采纳两性霉素B的最大效果(有效剂量,ED)。在计算机程序Microsoftxa0Officexa0Excelxa02003的帮助下进行统计处理。通过学生t-标准比较,显著性采纳平均差别为P≤0.05。得到的结果示于表15中。两性霉素B,在其被研究的最高剂量下(1,25mg/kg/d,≈62%,得自MTD),显示最大活性,被接受作为活性的标准。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="432"/>基于基因操作合成另外的化合物已经制备了各种另外的可操作的骨架结构。使用上述的化学,可将各种不同的官能团连接于游离的COOH和胺基上。这些基础结构都形成了本发明的另外的优选化合物(H原子未示出)。B1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="477"/>在制霉菌素PKS中的ER5和DH15结构域的失活,无C-10羟基化。B2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="443"/>在制霉菌素PKS中ER5和KR16结构域的失活B3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="526"/>在制霉菌素PKS和NysN单加氧酶中ER5、DH15结构域的失活,无C-10羟基化。B4ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="515"/>在制霉菌素PKS和NysN和NysL单加氧酶中ER5结构域的失活。B5ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="579"/>在制霉菌素PKS和NysN单加氧酶中ER5和KR14结构域的失活。B6ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="529"/>在制霉菌素PKS和NysL单加氧酶中ER5结构域的失活。B7ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="530"/>在制霉菌素PKS和NysN单加氧酶中ER5和KR16结构域的失活。构建突变株B2构建用于KR16失活的基因置换载体通过XbaI切除重组噬菌体N20的全长14kb的插入片段(Brautaset等人,2000)并将其克隆到质粒pGEM-3zf中,得到pL20X。从该质粒,切除3.7kbxa0BamHI片段并连接到pGEM-3zf中,形成质粒pGEMB3.7。然后通过使用以下的引物,从pGEMB3.7进行0.8kbxa0DNA片段(包含KR16活性位点残基Y3404)的PCR扩增:KR16-F1:5’-ttttctgCAGCCGACCGGCACCGTCC-3’(正义),和KR16-1R:5’-ttttaaGCTTCCTGGACCGCGCGGG-3’(反义)PCR产物用PstI和HindIII(在两个PCR引物中加下划线的新的识别位点)进行末端消化,并且将其克隆到pLITMUS28的相应位点内,得到pLITPH0.8。后一质粒充当KR16活性位点的位点定向诱变的模板,使用以下的诱变寡核苷酸:mutKR16-1F:5’-CCCCGGCCAGGCCGGCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="84"/>GCCGCCAACGCGGTCC-3’(正义)mutKR16-1R:5’-GGACCGCGTTGGCGGCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="85"/>GCCGGCCTGGCCGGGG-3’(反义)突变核苷酸以粗体表示,被引入的新的BstBI识别位点加下划线。通过使用这两个寡核苷酸,KR16活性位点Tyr被置换进入Phe内并且同时下一个下游Ala被Glu置换,得到双突变株YA3404FE。具有正确突变的质粒用BstBI消化进行鉴定,并且对全克隆的插入片段进行测序以阐明任何其它的不希望的突变。从正确突变的质粒切除627bpBpu102I/Bpu10I片段并用其置换质粒pGEMB3.7的相应片段,得到质粒pGEMB3.7m。从后一个质粒,使用EcoRI/HindIII切除全3.7kb插入片段并将其与pSOK201的3.1kbxa0EcoRI/HindIII骨架连接到一起,得到基因置换载体pKR16m。基因置换通过双重同源重组,将后一载体引入到nysA-缺陷的诺尔斯氏链霉菌突变株GG5073SP(Borgos等人,2006)。使用PCR+BstBI消化以及Southern印迹来验证正确的染色体KR16突变,然后根据其它地方所述(Brautaset等人,2003),通过引入反式nysA基因恢复多烯的产生。得到的突变株被指定为B2。构建突变株B7通过双重同源重组,将质粒pKOnysN-CL346AS(参见PNAS-manus)引入到nysA-缺陷的B2中。使用PCR和NheI消化以及Southern印迹来验证正确的染色体nysN突变,然后根据其它地方所述(Brautaset等人,2003),通过引入反式nysA基因恢复多烯的产生。得到的突变株被指定为B7。构建突变株B5构建用于KR14失活的基因置换载体切除质粒pL20X的4.0BclI/EcoRI片段(参见上述的策略B2)并连接到用BamHI/EcoRI消化的pGEM-3zf中,得到pBE4.0。通过使用以下引物,从后一质粒进行1kb片段的PCR扩增:KR14-F1:5’-TTCGGCGGCGTAATCTCC-3’(正义),和KR14-R1:5’-ttttaaGCTTCCACGGCGAGGTGC-3’(反义)用SacI和HindIII(在引物中加下划线的新的识别位点)消化PCR片段并连接到pLITMUS28中,得到pLITHS1.0,并将后一质粒用作KR14活性位点的位点定向诱变的模板,使用以下的诱变寡核苷酸:KR14-mut1:5’-CCCGGGCCAGGCCAACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="83"/>GCTGCCAACGCCGTCCTG-3’(正义),KR14-mut2:5’-CAGGACGGCGTTGGCAGCntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="83"/>GTTGGCCTGGCCCGGG-3’(反义)突变核苷酸以粗体表示,被引入的新的BstBI识别位点被加下划线。通过使用这两个寡核苷酸,KR14活性位点Tyr被置换进入Phe内并且同时下一个下游Ala被Glu置换,得到双突变YA9197FE。具有正确突变的质粒用BstBI消化进行鉴定并且对全克隆的插入片段进行测序以阐明任何其它的不希望的突变。从正确突变的质粒切除0.7kbFseI/AscI片段并用来置换质粒pBE4.0的相应片段,得到pBE4.0mut。从后一个质粒,使用EcoRI/HindIII切除全长为4.0kb的插入片段并将其与pSOK201的3.1kbxa0EcoRI/HindIII骨架连接到一起,得到基因置换载体pKR14m。基因置换通过双重同源重组,将后一载体引入到nysA-缺陷的诺尔斯氏链霉菌突变株GG5073SP(Borgos等人,2006)。使用PCR+BstBI消化以及Southern印迹来验证正确的染色体KR14突变,然后根据其它地方所述(Brautaset等人,2003),通过引入反式nysA基因恢复多烯的产生。得到的突变株被指定为BSG015。然后,通过双重同源重组,将nysN失活载体pKOnysN-CL346AS(参见PNASxa0manus)引入到nysA缺陷的BSG015中。使用PCR和NheI消化以及Southern印迹来验证正确的染色体nysN突变,然后根据其它地方所述(Brautaset等人,2003),通过引入反式nysA基因恢复多烯的产生。得到的突变株被指定为B5。构建突变株B4构建用于nysL失活的基因置换载体。已经描述了在符合读框的缺失质粒pNLD1中的nysL基因置换(Volokhan等人,2006),并且该质粒的4.2kb克隆插入片段包括诺尔斯氏链霉菌nysN编码区的区域。为了将nysL突变引入到nysN-CL346ST突变株背景中,我们不得不修饰该质粒以便还包含这一nysN突变。这根据如下进行:切除质粒pSOK201nysN4.1-CL346ST的1011bpAgeI/FspaI片段(参见Biosergen的专利申请,2007年5月)并用于置换质粒pNLD1的相应片段,得到基因置换质粒pNLD2。基因置换:通过双重同源重组将质粒pNLD2引入到nysA缺陷的化合物1中。使用PCR和NheI消化以及Southern印迹来验证正确的染色体nysL突变,然后根据其它地方所述(Brautaset等人,2003),通过引入反式nysA基因恢复多烯的产生。得到的突变株被指定为B4。B1和B3NysJ的DH15活性位点His966的失活:目的:将位点特异性突变引入到nysJxa0DH15活性位点中,导致在DH15结构域中的置换突变H966F。过程:-用BclI+SphI消化pL20X并将3.33kb片段克隆到用BamHI/SphI消化的pGEM11-zf中=pDH15-A-用EcoRI+HindIII消化pDH15-A并将3.34kb片段克隆到相应的位点pGEM3-zf中=pDH15-B-使用pDH15-B模板进行位点定向诱变并使用以下的诱变寡核苷酸:Mut-DH15-1:5’-CACCCCTGGCTCGCCGACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="42"/>GTCGTCGGCGGCATGGTC-3’Mut-DH15-2:5’-GACCATGCCGCCGACGACntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="45"/>GTCGGCGAGCCAGGGGTG-3’-突变核苷酸用粗体表示。突变破坏了在该位置的天然BtrI位点。-使用BrtI消化和DNA测序验证正确的突变=pDH15-Bmut-分离pDH15-B的1.6kbxa0EcoRI/SacI片段;得自pDH15-B的1.1kbxa0HindIII/BglII片段,和得自pDH15-Bmut的SacI/BglII片段-3,并将所有三个片段与3.1kbxa0pSOK201xa0EcoRI/HindIII骨架连接在一起;pDH15-123-进行诺尔斯氏链霉菌中的基因置换-证实正确的诺尔斯氏链霉菌DH15突变-在NotI消化总的DNA后通过Southern印迹并使用pDH15-A的标记3.33插入片段作为探针,可以验证第一交换突变株。野生型将给出5.2+8kb信号的,而正确的第一交换突变株(都是理论变异体)将给出5.2+6.4+8kb的信号。-使用以下的引物通过PCR分析第二交换突变株:○DH15-F:5’-CCTTCCTCGAACTCGGCC-3’○DH15-R:5’-GCGTAGATCTCGGTGTCG-3’-这将给出817bp的产物。得自母株的PCR产物可用BtrI进行消化,给出392bp和425bp的片段,而得自该突变株的PCR产物不能用BtrI进行切割。另外,第二突变株还可通过Southern印迹,使用标记的817bpxa0PCR产物作为探针进行验证。用BtrI消化的母株DNA将给出0.95kb+0.45kb的杂交片段,而得自该突变株的BtrI消化的DNA将给出一个1.4kb的杂交片段。构建突变株B1将DH15突变引入到nysA缺陷的GG5073SP株中,然后用反式nysA基因对正确的突变株进行互补。构建突变株B3将nysN-CL346ST突变引入到nysA缺陷的B1-S1遗传背景中,用反式nysA基因将得到的正确的突变株互补,得到突变株B3-1S。两性霉素B和新型的S44HP类似物在播散性念珠菌病的中性粒细胞减少性小鼠模型中的体内效力在感染前1天,通过以2×100mg/kg体重腹膜内注射环磷酰胺一水合物(Fluka,BioChemika,Sigma-Aldrich,Switzerland),造成小鼠中性粒细胞减少。在开始抗生素治疗前2小时,通过中性粒细胞减少性小鼠的尾侧静脉注射3×10⁵个CFU/ml的接种物,实现白色假丝酵母的播散性感染。在4天治疗后(每天1个剂量),通过评价肾的真菌负荷来评定抗生素在消除白色假丝酵母感染中的效力。结果示于图17中。两性霉素B以最高剂量2mg/kg(刚好低于MTD)施用。这些结果清楚地显示了化合物28和化合物29显著优于两性霉素B,因为:1)它们的急性毒性降低约1/5-1/7;2)它们在中性粒细胞减少性小鼠模型中,在播散性念珠菌病的治疗中显示了5-10倍的更好的效力;3)它们可溶于5%葡萄糖(>10mg/ml),而两性霉素B的溶解度<1mg/ml。虽然在念珠菌病的中性粒细胞减少性小鼠模型中化合物25和化合物26比两性霉素B的活性低,但是它们显示了低得多的急性毒性(是两性霉素B的大约1/20),因此仍被认为是感兴趣的候选物。